吡拉西坦顆粒微生物限度檢查方法學(xué)驗證

王杰，劉澎浩邦，肖欽欽，章瑛，張春華，劉緒平

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330029

吡拉西坦是一種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦代謝改善藥，屬于γ-氨基丁酸的環(huán)形衍生物。適應(yīng)證為腦動脈硬化癥、腦血管意外等多種原因所致的記憶和思維功能減退，亦可用于老年精神衰退綜合征、老年性癡呆、兒童智力發(fā)育遲緩等［1-5］。藥品的微生物限度檢查在藥品質(zhì)量控制和制劑安全性檢查方面至關(guān)重要［6-7］。根據(jù) 2015 年版《中國藥典》四部中1105、1106、1107 項下要求［8］，本實驗對吡拉西坦顆粒的微生物限度檢查法進(jìn)行驗證，并進(jìn)行微生物檢查，確保吡拉西坦顆粒微生物限度檢查符合要求。

1 儀器與材料

1.1 1 儀器

高壓蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)），電子天平（北京賽多利斯），凈化工作臺（蘇州凈化有限公司），細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)），霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒）。

1.2 材料

試藥：吡拉西坦顆粒（江西億友藥業(yè)有限公司，批號20180402、20180403、20180404，規(guī)格：5 g∶2.4 g），pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號200719，北京陸橋）。

培養(yǎng)基：麥康凱液體培養(yǎng)基（批號171103），胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號110422），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號170112），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號170615），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號171114），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號170811），以上培養(yǎng)基均來自北京陸橋。

菌種：金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均來源于中國食品藥品檢定研究院，所用均為2 代菌株。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

按照《中國藥典》2015 年版四部通則1105 檢查項中的方法，將各試驗菌制成適宜濃度的菌液。

2.2 微生物限度檢查方法驗證

2.2.1 供試液制備1∶10 供試液 取吡拉西坦顆粒10 g，置無菌錐形瓶中，加入稀釋液（pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）至100 mL，振搖溶解，即得。

2.2.2 計數(shù)方法適用性試驗試驗組 取配制的1∶10的供試液5 份，每份9.9 mL，每份中加入試驗菌液0.1 mL，使供試液中含菌量不大于100 cfu/mL。取上述試液注入2 個平皿，使每個平皿1 mL，每個平皿加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，再將平皿置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；取配制的1∶10 的供試液2 份，每份9.9 mL，每份中加入試驗菌液0.1 mL，使供試液中含菌量不大于100 cfu/mL。取上述試液注入2個平皿，使每個平皿1 mL，每個平皿加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，再將平皿置23 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。供試品對照組：稀釋液代替菌液，其他操作同試驗組。菌液對照組：以稀釋液替代供試液，其他操作同試驗組。

回收比值計算如下：回收比值=(試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù))/菌液對照組菌落數(shù)。計算結(jié)果見表1 與表2?？梢?，采用常規(guī)法，各實驗菌回收率均在0.5～2.0 的范圍內(nèi)，表明該微生物限度檢查方法符合2015 年版《中國藥典》微生物限度檢查的驗證要求［9］。

表1 需氧菌總數(shù)驗證結(jié)果

表2 霉菌和酵母菌總數(shù)驗證結(jié)果

2.3 控制菌（大腸埃希菌）檢查

試驗組：取1∶10 的供試液10 mL，置錐形瓶中，加入胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基100 mL，加入小于100 cfu 的大腸埃希菌液，置33 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取上述培養(yǎng)物1 mL，置加有100 mL 麥康凱液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，置42 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)取上述培養(yǎng)物通過劃線法，將其接種于麥康凱瓊脂平板上，置33 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，觀察結(jié)果。菌液對照組：以稀釋液代替供試品溶液，其它同試驗組。供試品組：以等量稀釋液替換菌液，其它和試驗組同法操作。稀釋液組：以等量稀釋液替換供試品溶液，并且不加菌液至錐形瓶中，其它和試驗組同法操作。

結(jié)果：試驗組和菌液對照組的麥康凱瓊脂平板上有大腸埃希菌生長，供試品對照組和陰性對照組的麥康凱瓊脂平板上均無菌生長。表明吡拉西坦顆粒在該條件下，對大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。說明可以采用該法進(jìn)行吡拉西坦顆粒的大腸埃希菌檢查。

2.4 樣品微生物限度檢查

采用常規(guī)法對三批吡拉西坦顆粒進(jìn)行需氧菌總數(shù)的檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)及控制菌的檢查，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，建立的檢查方法可用于吡拉西坦顆粒微生物限度的檢查。

表3 3批樣品微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

在藥品的生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸、存儲等環(huán)節(jié)中，一些外在的因素會造成微生物對藥品的污染，進(jìn)而對人體造成各種危害［11］，藥品微生物限度檢查的過程中，檢驗環(huán)境以及檢測人員等都會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，同時操作步驟較多，因此在考慮到吡拉西坦本身無抑菌性，因此用平皿法進(jìn)行微生物檢查并進(jìn)行方法學(xué)驗證，以減少可能造成的污染，從而確保檢驗方法的準(zhǔn)確性［12］。

吡拉西坦是一種作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦代謝改善藥，屬于γ-氨基丁酸的環(huán)形衍生物，具有保護(hù)及修復(fù)腦細(xì)胞的作用，改善腦代謝，增加腦血流量，改善腦神經(jīng)功能。結(jié)合其化學(xué)結(jié)構(gòu)，初步判斷本品無抑菌性，為確保常規(guī)法配制的溶液不抑制實驗菌的生長，本研究對檢驗方法進(jìn)行了回收率實驗，結(jié)果表明1∶10 的供試液各實驗菌回收比值均符合規(guī)定［10］。采用常規(guī)法作為本品的微生物的檢查方法是可行的。