HPLC 法測定復(fù)方鮮竹瀝液（無糖型）中甜菊苷的含量

吳春花，李詒光，張民，胡子慶，楊凌宇

江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330000

復(fù)方鮮竹瀝液為口服液，處方由鮮竹瀝、魚腥草、生半夏、生姜、枇杷葉、桔梗、薄荷素油組成，具有清熱化痰，止咳之功，臨床用于治療支氣管炎，咳嗽性哮喘，慢性阻塞性肺疾?。?-6］等。該品種的制法項(xiàng)規(guī)定添加蔗糖或甜菊素等甜味劑。無糖型添加甜菊素作為甜味劑。甜菊素又稱甜菊糖苷或甜菊糖，是從甜葉菊的葉子中提取的一種甜味劑，為四環(huán)二萜類化合物［7］，憑借其熱量低、易溶于水或酒精，也具耐熱性，可謂無熱量之代糖產(chǎn)品，是糖尿病患者的飲食或瘦身食品常用甜味料，可以廣泛用于各類食品、醫(yī)藥等。《中國藥典》2020 年版四部規(guī)定“本品是以甜菊素為主的混合苷。按干燥品計(jì)算，含甜菊糖苷以甜菊苷（C38H60O18）不得少于95.0%”，含量的測定采用容量法［8］。甜菊糖苷在食品行業(yè)中應(yīng)用非常廣泛,其定量方式則是采用反相HPLC 法測定其總甜菊糖苷［9-10］。市面上存在不同用途的甜菊素，有食品級的、有藥用輔料的，價格則存在十幾倍差，甜菊素作為輔料添加進(jìn)中成藥中已無法采用容量法測定其量，本研究嘗試采用HPLC 法測定其含量，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供一定的依據(jù)。

1 材料與儀器

安捷倫1260 型高效液相色譜儀，Agilent Chem Station for LC Systems 色譜工作站（DAD 檢測器）；色譜柱：CAPCELL PAK C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；BT25S 型電子天平；Secura 125-1CN 電子天平。

甜菊苷對照品（批號：P15J10F90774，含量98.0%），購于上海源葉生物科技有限公司。復(fù)方鮮竹瀝液（江西A 廠家，批號分別為：191203、200110、191205，江西B 廠家，批號分別為：191245、191048、191049）；陰性樣品：取缺輔料甜菊素的其余各藥材，按處方量及工藝自制陰性；水為去離子超純水，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：CAPCELL PAK C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（33∶67）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：210 nm。理論塔板數(shù)按甜菊苷峰計(jì)算不低于4 000。

2.2 樣品溶液

精密吸取本品1 mL，置10 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 對照品溶液

精密稱取甜菊苷對照品10.81 mg（含量為98.0%），置50 mL 量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液。

2.4 陰性對照品溶液

按復(fù)方鮮竹瀝液處方，不加輔料甜菊素，按“2.2”方法制備陰性對照溶液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

取甜菊苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10 μL，照“2.1”項(xiàng)條件試驗(yàn)。結(jié)果復(fù)方鮮竹瀝液（無糖型）樣品中呈現(xiàn)與甜菊苷對照品保留時間相同的色譜峰，而陰性對照則無相對應(yīng)的色譜峰，無其他成分干擾，見圖1。

圖1 HPLC圖

2.5 方法學(xué)研究

2.5.1 線性關(guān)系的考察 精密吸取“2.3”中甜菊苷對照品溶液各2、5、10、15、20、25、30 μL 進(jìn)樣，用安捷倫液相色譜儀進(jìn)行分析，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定甜菊苷的峰面積，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸，線性回歸方程為y=250.61x+0.977 6，R=1.000 0（n=7）。甜菊苷在0.211 9～3.178 1 μg 范圍內(nèi)呈良好的線性。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.3”中甜菊苷對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)行測定6 次，測定甜菊苷峰面積分別為265.3、266.8、266.2、267.2、266.7、266.1，其RSD 為0.3%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品溶液（批號200110）10 μL，依次在0、5、10、12.5、15、17、30 h，重復(fù)進(jìn)樣，測定峰面積分別為234.5、231.2、230.2、230.9、231.3、230.5、228.6，RSD 為0.8%（n=7），結(jié)果供試品溶液中甜菊苷在30 h 內(nèi)峰面積無明顯變化，表明樣品在30 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量取同一批樣品（批號為200110）5 份，照“2.1”項(xiàng)下方法，依法測定，其結(jié)果分別為1.872 8、1.868 8、1.877 6、1.833 0、1.901 8 mg/mL，RSD 為1.3%（n=5），結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收試驗(yàn) 取樣品同一批樣品（批號200110），適量，混勻，分別精密吸取6 份，每份0.5 mL，分別置10 mL 量瓶中，精密加入含適量甜菊苷對照品的50%甲醇溶液5 mL，照“2.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，結(jié)果測得平均回收率為99.43%（n=6），適合本品的含量測定。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 耐用性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下同一批樣品（批號為200110）溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法測定，再分別用三種不同型號的C18柱（CAPCELL PAK C18柱、Waters Symmetry? C18 柱、GRACE AlltimaTM C18 柱）進(jìn)行測定，結(jié)果甜菊苷峰在各種色譜柱均分離良好，測得含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 色譜柱考察測定結(jié)果

2.6 樣品測定

取本品6 批，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。

表3 甜菊苷的含量

3 討論

3.1 檢測方法的比較

劉景彬等［11］采用容量法與HPLC 法測定甜菊糖苷含量結(jié)果進(jìn)行了比較，彭慶蕤等［12］則分別采用容量分析法、正相HPLC 法和反相HPLC 法測定總甜菊糖苷的定量分析方法比較，其中反相HPLC法受干擾小，且與實(shí)際結(jié)果較為接近。

3.2 色譜條件的選擇

本研究中通過對甜菊苷在400～200 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果為末端吸收,考慮搭配樣品中峰雜質(zhì)大，故以210 nm 為檢測波長。通過比較甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)，在乙腈水系統(tǒng)下能較好的將甜菊苷與相鄰的雜質(zhì)峰分離，故最終確定以乙腈-水（33∶67）為流動相，在該色譜條件下，各色譜峰分離良好，峰形對稱。

3.3 供試品制備方式的考察

考察了不同提取溶劑（水、甲醇、50%甲醇）、提取方式（直接稀釋至刻度、超聲處理），結(jié)果表明提取溶劑采用50%甲醇直接稀釋即可，峰形對稱。

3.4 對6 批樣品結(jié)果的探討

6 批復(fù)方鮮竹瀝液（無糖型）中甜菊苷的含量測定結(jié)果從0.22～1.87 mg/mL，RSD 為77.8%，最大與最小值相差8.5 倍，同時也可以發(fā)現(xiàn)同一廠家所用甜菊素輔料質(zhì)量是較穩(wěn)定，不同廠家所用的輔料質(zhì)量則相差加大。由于數(shù)據(jù)量有限，對于如何采用甜菊苷該指標(biāo)來評價藥用輔料甜菊素有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

采用HPLC 法對復(fù)方鮮竹瀝液（無糖型）中甜菊素進(jìn)行定量分析。該方法快速簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于評價復(fù)方鮮竹瀝液中藥用輔料甜菊素的質(zhì)量。