近紅外光譜法快速檢測藜麥蛋白含量

張晉 曹曉寧 田翔 劉思辰 秦慧彬 喬治軍

摘要?[目的]建立一種藜麥粗蛋白含量快速、無損、簡便的測定方法，為藜麥的資源評價和品質(zhì)育種提供技術(shù)支持。[方法]以100份藜麥種質(zhì)資源為材料，其中80%為校正集，20%為驗證集，掃描得到藜麥近紅外原始光譜，利用OPUS/QUAN T5.5光譜定量分析軟件建立藜麥蛋白質(zhì)含量的快速檢測模型。[結(jié)果]采用一階導數(shù)+矢量歸一化光譜方法進行預(yù)處理，結(jié)合化學方法測定數(shù)據(jù)建立藜麥粗蛋白近紅外定量模型，校正和預(yù)測效果最好，藜麥粗蛋白近紅外定量模型的交叉驗證決定系數(shù)為0.918 2，外部驗證決定系數(shù)為0.915 1。[結(jié)論]基于近紅外光譜法（NIRS）測定藜麥籽粒的蛋白含量是完全可行的。

關(guān)鍵詞?藜麥;蛋白;含量;近紅外光譜技術(shù)

中圖分類號?TS210.7?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）09-0175-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.047

Abstract?[Objectives]In order to provide technical support for quinoa resource evaluation and quality breeding，and establish a fast，non-destructive，and simple method for determining quinoa protein content.[Method]A total of 100 quinoa varieties were selected，which 80% were used as the modeling set and 20% were used as the verification set.We collected 100 the near infrared spectra of quinoa，the OPUS/QUAN T5.5 software were used to preprocess the original near-infrared spectra data after scanning，and established the quantitative prediction model of quinoa kernel protein content.[Result]Through the preprocessing of first derivative and vector normalization spectral method，and set up the near infrared quantitative model of quinoa protein combining with the data of chemical method，whose calibration and prediction effect was best.Cross validation decision coefficient and external validation decision coefficient of protein by near infrared quantitative model were 0.918 2 and 0.915 1.[Conclusion]It is completely feasible to determine the protein content of quinoa grains based on near-infrared spectroscopy （NIRS）.

Key words?Quinoa;Protein;Content;Near infrared spectroscopy

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）原產(chǎn)于南美洲安第斯山地區(qū)，有 5 000～7 000 年種植歷史[1-3]，具有耐寒、抗旱耐逆、耐鹽堿等特性[4]。由于其營養(yǎng)的均衡性[5]，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（ FAO） 推薦為適宜人類食用的“全營養(yǎng)食品”，在國內(nèi)受到了越來越多的關(guān)注[6-10]。藜麥籽粒蛋白質(zhì)含量高[11]，溶解性好，容易被人體吸收利用，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[12]，富含多種氨基酸，尤其是植物蛋白中所缺乏的賴氨酸、色氨酸等[12-13]。因此蛋白質(zhì)含量作為評價藜麥品質(zhì)的重要指標，對藜麥資源評價、育種材料的篩選具有重要作用。蛋白質(zhì)含量的測定一般使用凱式定氮法、高效液相色譜法[14]，這些方法步驟煩瑣、速度慢、費用高、周期長，不適宜批量對藜麥資源品質(zhì)評價、育種過程中早代材料的快速、無損檢測。因此建立一種快速無損檢測藜麥蛋白含量的模型和方法，對藜麥種質(zhì)資源評價鑒定具有重要意義，同時將極大地推進育種進程，提高種質(zhì)資源的利用效率。

近紅外光譜分析技術(shù)是近年來發(fā)展快速、最引人注目的光譜分析技術(shù)[15]，具有適合多組分測定、分析速度快、測定過程無污染、操作簡便、成本低等優(yōu)點[16]，已成為品質(zhì)分析的重要手段和發(fā)展方向[17]，在玉米、大豆、花生、谷子等作物中均廣泛應(yīng)用[18-21]。目前關(guān)于藜麥籽粒蛋白含量近紅外研究較少，曹曉寧等[22-24]建立了基于近紅外光譜法快速檢測藜麥脂肪、纖維和淀粉的模型，石振興等[25]建立了基于藜麥粉的粗蛋白、粗脂肪和淀粉含量近紅外預(yù)測模型，均未對藜麥籽粒蛋白含量的近紅外模型進行研究。該研究基于藜麥籽粒蛋白質(zhì)含量的真實值，利用MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀和OPUS建模軟件，建立藜麥蛋白質(zhì)近紅外光譜分析模型，為藜麥品質(zhì)育種與資源評價提供技術(shù)支持。

1?材料與方法

1.1?試材?以中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所外引室以及山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)基因資源研究中心提供的100 份藜麥品種（系）為試驗材料。試驗所需試劑為無水乙醇、硼酸、氫氧化鈉、溴甲酚綠、濃硫酸、甲基紅、硫酸銅和硫酸鉀。

1.2?儀器

分析天平;電熱恒溫鼓風干燥箱;旋風磨（Foss Cyclotec1093）; MPA傅立葉變換近紅外光譜儀（德國Bruke公司）;FOSS消化爐（2012 型）;FOSS全自動凱氏定氮儀（8400 型）。

1.3?試驗方法

1.3.1?粗蛋白測定。根據(jù)GB 5511—2008，利用凱氏定氮儀計算粗蛋白含量進行藜麥籽粒蛋白含量的測定，每份樣品稱取2份，每份0.5 g，準確至0.001 g。

1.3.2?近紅外光譜的采集。

將藜麥樣品室溫下放置7 d，平衡水分，并去除雜質(zhì)。將近紅外光譜儀器開機預(yù)熱30 min，開始性能測試和白板參比，把樣品裝入樣品杯（容積25 cm3 ），每次裝樣以容積的2/3最佳，并將藜麥籽粒表面刮平。利用近紅外光譜儀采取藜麥樣品的漫反射光譜掃描光程進行優(yōu)化和選擇，每樣品掃描2次并取平均值，工作譜區(qū)為4 000～12 000 cm-1。

1.3.3?近紅外數(shù)學模型的建立。

采用光譜定量分析軟件和DPS 軟件，并利用軟件中的自動優(yōu)化功能，篩選建模的最佳光譜預(yù)處理方法、譜區(qū)范圍和主因子數(shù)。將藜麥樣品數(shù)據(jù)分為2組：校正集（80%用于建立近紅外模型）和驗證集（20%用于檢驗所建模型的精度）。為找到最優(yōu)建模方法，內(nèi)部驗證采用校正樣品集進行，利用建模之外的樣品對模型進行外部檢驗，來確定最優(yōu)模型。

2?結(jié)果與分析

2.1?藜麥原始光譜圖與化學值?從圖1可以看出，在光譜波段10 000～4 000 cm-1藜麥存在多個吸收峰，其變化趨勢一致但是不重合，說明該光譜圖質(zhì)量較高，待測樣品的前處理能夠達到試驗要求;同時樣品品質(zhì)的多樣性豐富，近紅外光譜圖能夠覆蓋較大范圍，可用于快速檢測模型的建立。

對藜麥樣品蛋白含量進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），藜麥粗蛋白含量是12.92%～15.62%，平均值為14.63%，數(shù)據(jù)變幅較寬，適合建立近紅外分析模型。

2.2?蛋白模型的建立

利用軟件中的自動優(yōu)化功能，發(fā)現(xiàn)采用一階導數(shù)+矢量歸一化法進行光譜預(yù)處理方法建立的蛋白含量校正模型的校正效果最好，交叉驗證決定系數(shù)為0.918 2，標準誤（RMSECV） 為0.155（圖2），說明通過此種方法建立的快速檢測模型是可行的，可應(yīng)用于大批量藜麥籽粒蛋白含量的快速檢測。

2.3?藜麥蛋白模型外部檢驗

利用驗證集的20份藜麥樣品對該研究所建模型質(zhì)量（預(yù)測效果）進行評價，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型的外部驗證決定系數(shù)為 0.915 1，預(yù)測標準誤為0.224，由此可見預(yù)測值與實際值之間沒有顯著差異，說明近紅外光譜儀測定的藜麥蛋白質(zhì)含量的結(jié)果是可靠的。

3?討論與結(jié)論

近紅外光譜分析技術(shù)在應(yīng)用中的準確性受到多種因素的影響[26]。建標樣品的數(shù)量和質(zhì)量是建立快速檢測模型的基礎(chǔ)，直接影響到結(jié)果的準確性。蔣煥煜等[27]研究發(fā)現(xiàn)溫度對模型精度有一定的影響，樣品的溫度在10 和20 ℃下模型的精度較高。王京宇等[28]研究發(fā)現(xiàn)水分含量也會影響利用近紅外測定蛋白質(zhì)含量結(jié)果的準確性。樣品粒度的變化可以對散射系數(shù)和吸光度產(chǎn)生影響，進而影響整個圖譜發(fā)生變化[29]。胡新中等[30]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量與顆粒度、灰分含量和顆粒度呈顯著正相關(guān)。待測樣品的處理和使用及預(yù)處理方法的不同也會影響近紅外光譜分析結(jié)果的準確性[31]。該研究利用MPA傅立葉變換近紅外光譜儀對100份藜麥籽粒樣本進行光譜掃描，通過光譜定量分析軟件進行光譜預(yù)處理、數(shù)學方法運算及回歸統(tǒng)計分析，建立了藜麥完整籽粒蛋白含量預(yù)測模型，決定系數(shù)較高、誤差小、可靠性較好，但今后的工作中仍需補充藜麥資源種類和數(shù)量，對模型進行校正和優(yōu)化[32]，保證模型的準確性和穩(wěn)定性?；诖朔椒ń说霓见湗颖臼峭暾?、籽粒無破損，滿足了快速、無損檢測要求，為藜麥品質(zhì)的評價指標如氨基酸含量的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。

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