肉雞滑液囊支原體的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)

劉春凌 王鵬 利凱

摘要?通過(guò)分離培養(yǎng)張家口某雞場(chǎng)MS菌株，采用PCR方法擴(kuò)增MS 16S RNA，并對(duì)分離培養(yǎng)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，感染MS肉雞站立困難，跗關(guān)節(jié)和爪墊腫脹，分離培養(yǎng)的病原體菌落為光滑、圓形，小面積“煎蛋樣”。PCR產(chǎn)物在207 bp處出現(xiàn)條帶。藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌落對(duì)酒石酸泰樂(lè)菌素和延胡索酸泰妙菌素敏感，最小抑菌濃度分別為0.122和0.244 μg/mL。因此，可確定該雞場(chǎng)已感染滑液囊支原體，推薦使用酒石酸泰樂(lè)菌素或延胡索酸泰妙菌素作為首選抑菌治療藥物。

關(guān)鍵詞?滑液囊支原體;分離;鑒定;PCR;藥敏試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)?S852.62?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A?文章編號(hào)?0517-6611（2021）09-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.09.023

Abstract?Mycoplasma synoviae（MS）strains were isolated from a chicken farm in Zhangjiakou and cultured，PCR method was used to amplify?16S RNA of MS. And drug sensitivity test was made on the isolated stains. The results showed that broilers infected with MS had difficulty in standing， swelling of the tarsal joints and paw pads，?and the isolated and cultured pathogen colonies were smooth， round， with “fried egg-like” small areas. PCR product showed a band at 207 bp. The drug susceptibility test showed that the colony was sensitive to tylosin tartrate and tiamulin fumarate， and the minimum inhibitory concentrations were 0.122 and 0.244 μg/mL， respectively.?Therefore， it could be determined that the chicken farm was infected with MS， and it was recommended to use tylosin tartrate or tiamulin fumarate as the first antibacterial medicine.

Key words?Mycoplasma synoviae;Isolation;Identification;PCR;Drug sensitivity test

滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是雞體中重要的致病性病原體之一，通過(guò)呼吸道感染進(jìn)入雞只體內(nèi)，會(huì)導(dǎo)致雞只生長(zhǎng)發(fā)育遲緩和滑膜炎的發(fā)生，同時(shí)容易與其他疾病混合感染，加劇死亡，給雞場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。MS同時(shí)具有水平傳播和垂直傳播的特性[3-4]。目前防治肉雞MS感染主要依靠抗生素，但隨著藥物使用時(shí)間的延長(zhǎng)和使用范圍的擴(kuò)大，其防治效果將越來(lái)越差。筆者通過(guò)分離培養(yǎng)張家口某雞場(chǎng)菌株，采用特異性PCR檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)，結(jié)合臨床癥狀和分離培養(yǎng)鑒別MS，并篩選出集中敏感藥物，以期為張家口地區(qū)MS病防治藥物的合理使用提供參考。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?培養(yǎng)基。

支原體精氨酸肉湯培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)HB7025-5）、支原體瓊脂培養(yǎng)基（編號(hào)HB7025-3）、支原體肉湯培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號(hào)HB7025-2），均購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2?主要試劑。

血液/細(xì)胞/組織基因組總RNA提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)ZP311），第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒-耐高溫酶（產(chǎn)品編號(hào)ZR102-1），2×Ftaq PCR MasterMix（產(chǎn)品編號(hào)ZT201-1），DL2000 DNA Marker（產(chǎn)品編號(hào)ZM404-1），GoldViewTM核酸染料I（產(chǎn)品編號(hào)ZS209），均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;標(biāo)準(zhǔn)小牛血清（產(chǎn)品編號(hào)CS-XQ0301），購(gòu)自上海莼試生物技術(shù)有限公司。

1.1.3?藥敏試驗(yàn)用藥。

延胡索酸泰妙菌素（批號(hào)為獸藥字300111320，購(gòu)自山東勝利生物工程有限公司），磷酸替米考星（批號(hào)為獸藥字190801599，購(gòu)自河北天象生物藥業(yè)有限公司），氟苯尼考（批號(hào)為獸藥字163231120，購(gòu)自華畜獸藥有限公司），鹽酸環(huán)丙沙星（批號(hào)為獸藥字150512606，購(gòu)自山東魯西獸藥股份有限公司），鹽酸多西環(huán)素（批號(hào)為獸藥字163236011，購(gòu)自華畜獸藥有限公司），硫酸慶大霉素（批號(hào)為獸藥原字110132337，購(gòu)自華北制藥有限責(zé)任公司），鹽酸林可霉素（批號(hào)為獸藥字161016081，購(gòu)自華畜獸藥有限公司），鹽酸沙拉沙星（批號(hào)為獸藥字161012630，購(gòu)自華畜獸藥有限公司），酒石酸泰樂(lè)菌素（批號(hào)為獸藥字161012733，購(gòu)自華畜獸藥有限公司）。

1.2?方法

1.2.1?支原體分離、鑒定培養(yǎng)基的制作。

嚴(yán)格按照支原體精氨酸肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基和支原體肉湯培養(yǎng)基產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)配制這3種培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻，加滅活小牛血清200 mL和青霉素80萬(wàn)單位，調(diào)節(jié)pH，加入無(wú)菌試管，備用。

1.2.2?病料采集與保存。

選取張家口某雞場(chǎng)20只疑似感染MS的肉雞，觀察其臨床癥狀。無(wú)菌收集疑似感染MS肉雞鼻孔、氣管拭子、腫脹關(guān)節(jié)液，編號(hào)標(biāo)記，接種于支原體精氨酸肉湯培養(yǎng)基，密封保存。37 ℃下孵育36 h，觀察培養(yǎng)基顏色的變化。

1.2.3?菌落的分離培養(yǎng)。

參照顧的樂(lè)[5]的MS分離鑒定步驟，無(wú)菌抽取少量已經(jīng)變黃的培養(yǎng)液，確定無(wú)雜菌后將可疑培養(yǎng)物在相同的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代7～8代，然后取0.30 mL培養(yǎng)物接種于支原體瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)12 d，待肉眼可見(jiàn)菌落時(shí)挑取單菌落涂片，吉姆薩染色后，置于顯微鏡10×10倍觀察菌落形態(tài)，并用滅菌注射器針頭挑取典型單菌，接種于培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

1.2.4?PCR鑒定。

利用“1.2.3”中獲取的分離菌株，參照石曉磊等[6]的試驗(yàn)方法，按照血液、細(xì)胞、組織基因組總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，并使用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)換為第一鏈cDNA作為模板，用16S rRNA基因通用引物 P1（5′-GAAGCAAAATAGTGATATCA-3′）和P2（5′-GTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′）對(duì)分離菌的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為RNA模板 0.5 μL，P1和P2各 1 μL，2×Ftaq PCR MasterMix 12.5 μL，用雙蒸水補(bǔ)至 25 μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性 3 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 1 min，共32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增片段為207 bp。

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物片段。

1.2.5?藥敏試驗(yàn)。

1.2.5.1?抗菌藥物的稀釋。

無(wú)菌稱(chēng)取抗菌藥物溶于稀釋液中，配成濃度10 mg/mL的原液，再用液體培養(yǎng)基將藥液稀釋至 1 mg/mL，每種藥物取0.5 mL，于38 ℃下培養(yǎng)3 d后觀察，以確保無(wú)真菌或細(xì)菌污染。

1.2.5.2?常用抗菌藥物最小抑菌濃度的測(cè)定。

參照石曉磊[7]的試驗(yàn)方法，對(duì)張家口地區(qū)分離鑒定的MS進(jìn)行最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）測(cè)定。在滅菌EP管中分別加入支原體肉湯培養(yǎng)基0.4 mL，每種藥品1組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15個(gè)梯度。于每組每個(gè)重復(fù)第1管加入上述抗生素溶液各0.4 mL，然后按1∶1倍比稀釋至第15管后棄去多余溶液，再分別加入40 μL待測(cè)菌液。將第16管作為陰性對(duì)照（培養(yǎng)基0.4 mL），第17管作為陽(yáng)性對(duì)照（培養(yǎng)基0.4 mL+40 μL待測(cè)菌液）。將稀釋好的菌液移至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，加蓋后置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中觀察7 d。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：第16管不變色，第17管由原來(lái)的無(wú)色變?yōu)辄S色且清澈透明。觀察試驗(yàn)孔的顏色變化，記錄無(wú)MS生長(zhǎng)的最大稀釋倍數(shù)，根據(jù)藥物稀釋濃度計(jì)算菌株的最小抑菌濃度。

2?結(jié)果與分析

2.1?臨床癥狀

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，肉雞站立困難，跗關(guān)節(jié)、腳墊腫脹，病雞俯臥不起。

2.2?菌落特征

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小面積、光滑、圓形、呈“煎蛋樣”的致密菌落（圖1）。

2.3?PCR鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，可見(jiàn)在207 bp處出現(xiàn)條帶（圖2）。純化菌株能擴(kuò)增出特異性的雞滑液囊支原體目的片段，擴(kuò)增片段與預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段相符。

2.4?藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，酒石酸泰樂(lè)菌素的最小抑菌濃度（MIC）最高，為0.122 μg/mL;其次為延胡索酸泰妙菌素，為0.244 μg/mL;磷酸替米考星為3.906 μg/mL;鹽酸多西環(huán)素為7.813 μg/mL;鹽酸林可霉素排在第5位，其MIC為15.625 μg/mL;氟苯尼考MIC為31.250 μg/mL，鹽酸環(huán)丙沙星和硫酸慶大霉素均為62.500 μg/mL;鹽酸沙拉沙星最不敏感，其MIC值為125.000 μg/mL。

3?討論

MS是最重要的肉雞致病性支原體之一。很多人認(rèn)為MS感染是一種亞臨床呼吸道感染[8]，但越來(lái)越多報(bào)道表明MS可帶來(lái)嚴(yán)重的呼吸道感染和關(guān)節(jié)雞病，給肉雞養(yǎng)殖帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9-11]。

該研究從張家口某雞場(chǎng)疑似感染MS的肉雞鼻孔、氣管和跗關(guān)節(jié)液中成功分離培養(yǎng)出MS菌落，固體培養(yǎng)基上菌落小，圓形，光滑，有致密中央隆起，呈“煎蛋樣”。結(jié)合養(yǎng)殖場(chǎng)肉雞的臨床癥狀，鑒定為雞MS。這說(shuō)明該雞場(chǎng)存在MS感染，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可進(jìn)一步開(kāi)展藥敏試驗(yàn)，對(duì)臨床治療能起到指導(dǎo)作用。

該研究采用的PCR檢測(cè)方法可快速、靈敏準(zhǔn)確地鑒別檢測(cè)病原體，給臨床應(yīng)用提供了極大的便捷和實(shí)用性[12-13]。該研究采用Lauerman等[14]的種特異性引物，通過(guò)培養(yǎng)、血清學(xué)方面的比較，靈敏度為82%，特異性達(dá)100%。通過(guò)PCR方法確定該雞場(chǎng)雞群MS感染。

在臨床治療中應(yīng)對(duì)治療菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以選擇有效的抗菌藥物，防止藥物浪費(fèi)，節(jié)約治療成本，降低環(huán)境污染。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在延胡索酸泰妙菌素等9種抗生素中，雞MS臨床分離株對(duì)酒石酸泰勒菌素的MIC為0.122 μg/mL，延胡索酸泰妙菌素MIC為0.244 μg/mL，3株分離株MIC差異不顯著，說(shuō)明酒石酸泰樂(lè)菌素與延胡索酸泰妙菌素對(duì)該菌株抑制作用明顯。鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸慶大霉素的MIC為62.500 μg/mL，鹽酸沙拉沙星的MIC為125.000 μg/mL，抑菌效果不佳。該雞場(chǎng)MS敏感藥物為酒石酸泰樂(lè)菌素和延胡索酸泰妙菌素，推薦使用這2種藥物作為治療首選藥物。

參考文獻(xiàn)

[1] 招麗嬋，覃健萍，王占新，等.雞滑液囊支原體的流行調(diào)查及不同地區(qū)分離株藥物敏感性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2019，55（6）：9-13.

[2] 雷元元，郭亞男，郭磊，等.一起禽滑液囊支原體病的診斷及垂直傳播驗(yàn)證[J/OL].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2019-10-23[2020-04-25].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/31.2031.S.20191022.1705.004.html.

[3] CARNAGHAN R B A.Egg transmission of infectious synovitis [J].Journal of comparative pathology and therapeutics，1961，71（4）：279-285.

[4] TEBYANIAN H，MIRHOSSEINY S H，KHEIRKHAH B，et al.Isolation and identification of Mycoplasma synoviae from suspected ostriches by polymerase chain reaction，in Kerman Province，Iran[J].Jundishapur journal of microbiology，2014，7（9）：1-5.

[5] 顧的樂(lè).雞滑液囊支原體的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國(guó)新技術(shù)新產(chǎn)品，2014（13）：165-166.

[6] 石曉磊，齊田苗，邊海霞，等.寧夏地區(qū)雞滑液囊支原體的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，39（11）：134-136.

[7] 石曉磊.雞滑液囊支原體的分離鑒定及其活疫苗免疫效果的評(píng)價(jià)[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2018.

[8] VAN ECK J H，VAN KOL N，KOUWENHOVEN B.Egg production in relation to the results of a long term serological survey of 73 flocks of fowl[J].Veterinary quarterly，1980，2（1）：15-24.

[9] 夏道倫，黃曉蘋(píng).雞滑液囊支原體感染的流行及其防控措施[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2020（2）：43-46.

[10] 陳秀紅，郭亞男，司朵朵，等.寧夏地區(qū)雞滑液囊支原體病流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，42（3）：234-238.

[11] 郭亞男，郭朋輝，司朵朵，等.某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞滑液囊支原體的分離鑒定及跗關(guān)節(jié)病理組織學(xué)觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2020，41（4）：48-52.

[12] POURBAKHSH S A，SHOKRI G R，BANANI M，et al.Detection of Mycoplasma synoviae infection in broiler breeder farms of Tehran province using PCR and culture methods[J].Archives of razi institute，2010，65（2）：75-81.

[13] HEIDENREICH A，BELLMUNT J，BOLLA M，et al.EAU guidelines on prostate cancer.Part 1：Screening，diagnosis，and treatment of clinically localised disease[J].European urology，2011，59（1）：61-71.

[14] LAUERMAN L H，HOERR F J，SHARPTON A R，et al.Development and application of a polymerase chain reaction assay for Mycoplasma synoviae[J].Avian diseases，1993，37（3）：829-834.