白藜蘆醇對小鼠超排卵子質(zhì)量的影響

阿尼古力·沙比爾?甄雅惠?付玉霞?盛娟?阿依努爾·斯迪克?李瑞岐

【摘要】目的 研究白蘆藜醇（RSV）對小鼠超排卵效果及胚胎發(fā)育的影響。方法 以2～3月齡的CD-1小鼠為研究對象，在超排卵同時腹腔注射RSV（RSV組）或二甲基亞砜（DMSO組），觀察RSV對小鼠超排卵子質(zhì)量的影響。選取了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）、卵巢和睪丸組織的模板DNA，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分別檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1） mRNA在這三者中的表達情況。另外獲取小鼠P1卵丘細胞，設(shè)置DMSO組、RSV（1 μmol/L）組和EX-527（SIRT1的抑制劑，10 μmol/L）組，使用熒光免疫染色檢測各組SIRT的相對熒光強度、qRT-PCR檢測各組的mtDNA相對表達量。結(jié)果 RSV組的卵裂率和囊胚率均高于DMSO組（P均< 0.05）。體外實驗結(jié)果顯示，SIRT1 mRNA的相對表達量在卵巢是MEF的15～25倍（P < 0.001）。小鼠P1卵丘細胞在經(jīng)RSV處理后SIRT1熒光相對強度升高（P < 0.001）。在用RSV和EX-527分別處理小鼠卵丘細胞48 h后，RSV組mtDNA相對表達量高于DMSO組（P < 0.001），而EX-527組mtDNA相對表達量低于DMSO組（P < 0.01）。結(jié)論 小鼠超排卵時補充RSV能夠顯著改善卵子的發(fā)育潛能。

【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇;線粒體;線粒體DNA;卵子質(zhì)量;輔助生殖技術(shù)

Effect of resveratrol on the quality of oocytes after superovulation in mouse models Aniguli·Shabier， Zhen Yahui， Fu Yuxia， Sheng Juan， Ayinuer·Sidike， Li Ruiqi. Reproductive Medicine Center， the First Peoples Hospital of Kashgar， Kashgar 844000， China

Corresponding author， Li Ruiqi， E-mail： wxszzx@ 163. com

【Abstract】Objective To evaluate the effect of resveratrol （RSV） on the superovulation and embryonic development in mouse models. Methods In this study， CD-1 mice （2-3 months old） were selected. RSV （RSV group） or dimethyl sulfoxide （DMSO group） was injected intraperitoneally during superovulation to observe the effect of RSV on the quality of superovulated oocytes in mice. Template DNA of mouse embryonic fibroblasts （MEF）， ovary and testis tissues was extracted. The expression level of SIRT1 mRNA in these three tissues was detected by quantitative PCR. In addition， mouse P1 cumulus cells were obtained and divided into the DMSO， RSV （1μmol/L） and EX-527 （10 μmol/L inhibitor of SIRT1） groups. The relative fluorescence intensity of SIRT in each group was detected by immunofluorescence staining. The relative expression of mtDNA in each group was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The cleavage rate and blastocyst rate in the RSV group were significantly higher than those in the control group （both P < 0.05）. The results of in vitro experiments showed that the relative expression of SIRT1 mRNA in the ovary was 15-25 times of that in the MEF （P < 0.001）. The relative fluorescence intensity of SIRT1 in the P1 mouse cumulus cells was significantly increased after RSV treatment （P < 0.001）. After the mouse cumulus cells were treated with RSV and SIRT1 inhibitor （EX-527） for 48 h， the relative expression level of mtDNA in the RSV group was significantly higher than that in the DMSO group （P < 0.001）， whereas the relative expression level of mtDNA in the EX-527 group was significantly lower compared with that in the DMSO group （P < 0.01）. Conclusion RSV supplementation during superovulation can significantly improve the developmental potential of oocytes in mouse models.

【Key words】Resveratrol;Midtochondria;mtDNA;Oocyte quality;Assisted reproductive technique

改善卵子質(zhì)量，提高胚胎發(fā)育潛能一直是輔助生殖技術(shù)（ART） 所追求的目標(biāo)。近年來，越來越多的研究顯示，線粒體功能下降是造成卵子質(zhì)量下降的重要原因。白藜蘆醇 （RSV）又稱為芪三酚，是一類增強線粒體功能的藥物。有研究顯示，在卵母細胞體外成熟 （IVM） 時補充 RSV能夠提高胚胎的囊胚率[1]。超排卵過程是卵泡快速生長的時期，也是卵母細胞內(nèi)的線粒體和線粒體DNA（mtDNA）快速增殖的時期[2]。在此時補充 RSV會對超排卵產(chǎn)生什么樣作用，筆者尚未見有相關(guān)報道。為此，本研究在小鼠超排卵同時補充RSV，觀察其對超排效果的影響，并初步探討其可能的作用機制，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、實驗動物

本實驗所用小鼠為CD-1品系，超排卵實驗為12只2 ～ 3月齡的雌性小鼠，體質(zhì)量約30 g。獲取顆粒細胞所用小鼠為1月齡小鼠，體質(zhì)量約20 g。用于交配的雄鼠為4 ～ 5月齡，體質(zhì)量約50 g。本研究所用小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，所有實驗動物的飼養(yǎng)及操作均符合實驗動物倫理相關(guān)要求。

二、主要試劑和儀器

主要試劑孕馬血清促性腺激素（PMSG）、人絨毛膜促性腺激素（HCG）購自寧波三生藥業(yè)，二甲基亞砜（DMSO）、RSV、EX-527購自美國Sigma公司，KSOM坯胎培養(yǎng)液購自美國Millopore公司，熒光定量檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技股份有限公司，沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1）一抗購自美國Santa Cruz公司，Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、OCT4一抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器包括羅氏LightCycler 480實時熒光定量 PCR 儀、奧林巴斯CKX41倒置熒光顯微鏡。本研究中的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

三、小鼠超排方案及2-細胞期胚胎的獲取

12只雌性小鼠按隨機數(shù)表法分配到對照組（DMSO組）和實驗組（RSV組），每組6只小鼠，每只小鼠均予腹腔注射5 IU的PMSG。在此基礎(chǔ)上，對照組注射稀釋過的DMSO，實驗組注射RSV 20 mg/kg，該計量參考Park等[3]的研究。48 h后，2組小鼠均注射5 IU的HCG，同時對照組和實驗組分別再次注射相同劑量的DMSO和RSV。小鼠在注射后與成年雄鼠1∶1合籠。合籠的次日上午8∶00檢查是否交配成功，陰道口有精栓者（見栓）視為交配成功，交配成功的雌性小鼠和未交配成功的雌性小鼠分籠放置。交配成功30 h后取雌性小鼠的輸卵管進行沖胚。收集從輸卵管沖出的2-細胞期胚胎和未受精的卵母細胞進行統(tǒng)計，將2-細胞期的胚胎放入預(yù)平衡好的KSOM胚胎培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至囊胚階段（D4）。囊胚評分參考文獻[4]的標(biāo)準(zhǔn)，滋養(yǎng)層細胞完整、內(nèi)細胞團明顯的囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚。

四、SIRT1在小鼠睪丸和卵巢組織中的表達檢測

本實驗室前期制備了CD1小鼠多個器官組織的模板DNA（cDNA），本研究選取了小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）、卵巢和睪丸組織的cDNA，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分別檢測SIRT1在這三者中的表達情況。

五、原代小鼠卵丘細胞的獲取及培養(yǎng)

1月齡CD1雌性小鼠注射PMSG 48 h后獲取卵巢組織，用1 ml注射器針頭在體視顯微鏡下刺破卵泡，獲取未成熟的卵丘卵母細胞復(fù)合體（COC），之后用剝卵針將卵丘細胞剝掉，收集操作液并離心洗滌，最后將卵丘細胞接種到6孔板內(nèi)培養(yǎng)，此時卵丘細胞為P0代，培養(yǎng)基為DMEM/F12+10%胎牛血清。卵丘細胞長滿整個培養(yǎng)板后，按1∶3傳代（P1） [5]。小鼠P1卵丘細胞傳代12 h

后，各組加入相應(yīng)的處理藥物培養(yǎng)48 h。

六、mtDNA mRNA相對定量

為了驗證SIRT1在卵丘細胞中對線粒體增殖的作用，本研究設(shè)置3組，分別為DMSO組、RSV（1 μmol/L）組和EX-527（SIRT1的抑制劑，10 μmol/L）組，每組設(shè)置2個復(fù)孔，小鼠P1卵丘細胞處理48 h后通過qRT-PCR檢測各組mtDNA相對表達量。β-Globin引物：正向5-CGAACATACTGAACTGCTA-3，反向5-GACATATCTGACATCT CTACTT-3，產(chǎn)物長度為106 bp。mtDNA

引物：正向5- TACCTCACCATCTCTTGCTA-3，反向5-GCTACACCTTGACCTAACG-3，產(chǎn)物長度為114 bp。以總DNA為模板，β-Globin為內(nèi)參，按照qRT-PCR試劑盒說明書進行操作[5]。根據(jù)公式2-△△Ct進行mtDNA相對量的計算，目的基因相對表達量用目的基因與β-Globin 之比表示。

七、熒光免疫染色

具體過程參考既往文獻報道：使用SIRT1一抗與小鼠P1卵丘細胞進行共孵育，然后使用Alexa Fluor 555驢抗小鼠IgG進行標(biāo)記、OCT4抗體特異性識別囊胚內(nèi)細胞團細胞，再用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG進行標(biāo)記，最后用DPAI對所有囊胚細胞的細胞核進行染色，在倒置熒光顯微鏡下進行囊胚細胞計數(shù)[5]。SIRT1的熒光強度定量采用ImageJ軟件分析灰度值，結(jié)果以實驗組與對照組的相對值（對照組設(shè)為1）表示。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析，多重比較行Dunnet-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用Pearson χ2檢驗分析組間差異。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、RSV對小鼠自然受精胚胎發(fā)育的影響

小鼠的超排卵結(jié)果顯示，DMSO組和RSV組各有4只和6只小鼠見栓，取得RSV組2-細胞期胚胎和未受精（未卵裂）的卵母細胞共140枚，對照組2-細胞期胚胎和未受精（未卵裂）的卵母細胞共82枚，RSV組的卵裂率和囊胚率均高于DMSO組（P均< 0.05）。2組優(yōu)質(zhì)胚胎率和囊胚細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見表1、圖1。

二、SIRT1 mRNA在生殖細胞組織內(nèi)的表達情況

RSV的作用基因為SIRT1，為了檢測該基因?qū)ι臣毎淖饔茫狙芯恳許IRT1在MEF中的表達量為對照，檢測SIRT1在卵巢和睪丸組織內(nèi)相對于MEF的表達情況。結(jié)果顯示，SIRT1 mRNA在MEF、卵巢和睪丸組織中的相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 1303.958，P < 0.001）。其中，SIRT1 mRNA的相對表達量在卵巢是MEF的15 ～ 25倍（P < 0.001），提示SIRT1在卵巢中可能有重要的生物學(xué)作用，見圖2。

三、添加RSV對體外培養(yǎng)小鼠卵丘細胞SIRT1表達及mtDNA相對表達量的影響

為了觀察RSV對卵丘細胞SIRT1表達的影響，本實驗使用RSV處理P1代小鼠卵丘細胞48 h，

通過免疫染色對比SIRT1在RSV組和DMSO組中的表達情況。結(jié)果顯示，添加RSV后可提高SIRT1在卵丘細胞中的表達（t = -16.913， P < 0.001），見圖3A、B。進一步使用RSV和SIRT1抑制劑EX-527分別處理P1代小鼠卵丘細胞48 h，

然后檢測各組的mtDNA的相對表達量，結(jié)果顯示3組mtDNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 114.416，P < 0.001），其中EX-527 組的mtDNA相對表達量低于DMSO組（Dunnet-t = 5.899，P = 0.002），而RSV 組的mtDNA相對表達量高于DMSO組（Dunnet-t = 9.113，P < 0.001），見圖3C。

討論

卵母細胞質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)助孕成敗的關(guān)鍵因素，不僅影響胚胎的早期發(fā)育，甚至對后代的健康也會產(chǎn)生重大影響。高齡女性和卵巢儲備下降（DOR）患者的卵母細胞mtDNA拷貝數(shù)顯著低于年輕和非DOR患者卵母細胞的拷貝數(shù)。此外，胚胎的代謝情況也會有所改變[7]。低mtDNA量的卵母細胞產(chǎn)生的胚胎可能會在胚胎種植前激活mtDNA的復(fù)制，以補償卵母細胞mtDNA的不足，而這部分胚胎多數(shù)表現(xiàn)為染色體異常或者種植失敗[8]。近來越來越多的研究顯示，改善線粒體功能能夠提高卵子質(zhì)量，甚至可以逆轉(zhuǎn)年齡對卵子質(zhì)量的影響[10-11]。因此，提高卵母細胞線粒體的功能將成為改善卵子質(zhì)量的有力措施。

近來有研究顯示，RSV能夠提高人及小鼠IVM卵母細胞紡錘體的完整性，降低染色體的異常率，并能夠抵抗卵子體外的老化過程[12-14]。Liu等[15]研究顯示，對小鼠長期喂食RSV能夠降低卵母細胞的非整倍體率，并延長小鼠的繁殖期限。卵泡快速生長的時期也是卵母細胞內(nèi)的線粒體和mtDNA 快速增殖的時期，在補充RSV是否會改善超排卵子的發(fā)育潛能尚未有文獻對此進行報道。本研究在小鼠卵泡啟動和扳機時分別給予1次RSV刺激，結(jié)果顯示在此時補充RSV能提高小鼠胚胎體外培養(yǎng)的囊胚形成率。優(yōu)質(zhì)囊胚率和平均囊胚細胞數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能是RSV組卵裂的胚胎顯著增多，這些卵裂的胚胎中含有發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚的比例可能會被拉低;而DMSO組質(zhì)量不好的卵子可能不發(fā)生卵裂提前被淘汰了，從而含有高質(zhì)量卵裂胚胎的比例會相應(yīng)增加，最終導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)囊胚率在組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。雖然2組的優(yōu)質(zhì)囊胚率和囊胚細胞數(shù)相近，但是RSV處理后明顯改善了胚胎發(fā)育到囊胚的能力，因此我們認為超排卵時補充RSV能夠提高胚胎的發(fā)育潛能。另外，超排卵過程是卵泡快速生長的過程，卵母細胞內(nèi)的線粒體數(shù)量和mtDNA也在此時期快速增殖，因此我們選擇在此時補充RSV。但是在超排卵之前提前使用，延長使用時間以及改變劑量是否會產(chǎn)生不同的影響，還需要進一步研究。

RSV能夠通過SIRT1激活PGC-1α的活性，PGC-1α進一步激活線粒體增殖相關(guān)基因的表達，增強線粒體的功能，并促進mtDNA拷貝數(shù)的增加[3]。本研究顯示，SIRT1在小鼠卵巢和睪丸細胞中高表達（與小鼠成纖維細胞相比），說明SIRT1在生殖細胞中有重要的作用。通過在體外培養(yǎng)小鼠卵丘細胞過程中添加RSV，我們發(fā)現(xiàn)RSV能夠顯著提高卵丘細胞中SIRT1和mtDNA的表達量，而卵丘細胞mtDNA表達量與卵母細胞mtDNA表達量和卵母細胞的質(zhì)量密切相關(guān)[16-18]。由此推測，在體內(nèi)補充RSV能夠通過激活SIRT1基因的表達，并可能通過PGC-1α進而誘導(dǎo)線粒體的增殖，改善卵母細胞的質(zhì)量。

綜上所述，本研究初步證實在超排卵時補充RSV能夠改善小鼠超排卵子的質(zhì)量，提高胚胎發(fā)育潛能，但是能否在人ART中產(chǎn)生相似的效果還需要進一步研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-02-08）

（本文編輯：林燕薇）