基于還原態(tài)DES熒光特性測(cè)定槐米中槲皮素含量*

李祥昀，侯夢(mèng)園，李培培，劉艷菊

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450046

槐米又名白槐、槐花，是豆科植物槐的干燥花蕾?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，其藥性苦，微寒，歸肝、大腸經(jīng)，具有涼血止血、清肝瀉火等功效?；泵字兄饕钚猿煞譃辄S酮類物質(zhì)，如蘆丁、槲皮素等。槲皮素作為黃酮醇類代表性化合物，具有很高的藥用價(jià)值，能夠抗癌［1－3］、抗炎［4－5］、抗病毒［6］、保護(hù)心腦血管［7］、抗氧化［8］和抑制黑色素生成［9］。因此，快速、準(zhǔn)確測(cè)定槐米中槲皮素的含量具有重要意義。文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素含量測(cè)定的方法主要有高效液相色譜法［10－13］、化學(xué)修飾電極法［14］、薄層掃描色譜法［15］、高效毛細(xì)管電泳法［16］等。熒光分光光度法因具有簡(jiǎn)便、快速、專屬性好等特點(diǎn)得到了眾多學(xué)者的關(guān)注。目前，基于還原態(tài)DES（4，4′－二疊氮二苯乙烯－2，2′－二磺酸二鈉四水合物）的熒光特性，利用熒光分光光度法測(cè)定槐米中槲皮素含量的研究未見報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)DES自身沒有熒光，但其還原產(chǎn)物具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射?；泵字械幕钚猿煞珠纹に鼐哂休^強(qiáng)的抗氧化能力，可以還原DES，生成還原態(tài)DES，發(fā)出較強(qiáng)的熒光。本研究通過改變?nèi)芤旱膒H值、槲皮素濃度及槲皮素與DES反應(yīng)的時(shí)間等條件，對(duì)該方法的檢測(cè)性能進(jìn)行分析，建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速定量檢測(cè)槲皮素的熒光分光光度法，可用于槐米中槲皮素含量的檢測(cè)，為槐米的綜合開發(fā)及臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

FLS 1000熒光分光光度計(jì)（Edinburgh公司，英國(guó)），超純水儀（默克化工技術(shù)有限公司，上海）。

槐米購(gòu)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房（產(chǎn)地：安徽亳州，批號(hào)：190601），經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院謝小龍博士鑒定為豆科植物槐的干燥花蕾。槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：150803），購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。DES（4，4′－二疊氮二苯乙烯－2，2′－二磺酸二鈉四水合物），購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。三（羥甲基）氨基甲烷（Tris），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液溶解，得到4 mmol·L－1的槲皮素對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備取槐米粉末4 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇100 mL。水浴加熱至87℃，保持微沸回流120 min后趁熱過濾，然后用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇定容至100 mL，即得［17－19］。

2.3 檢測(cè)方法取4 mmol·L－1槲皮素對(duì)照品溶液20μL和DES（15 mmol·L－1）溶液50μL，室溫反應(yīng)5 min后，加入530μL Tris－HCl（0.1 mol·L－1，pH＝6）緩沖溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）為383 nm，狹縫寬度2 nm的條件下，測(cè)試溶液的熒光發(fā)射光譜。

2.4 可行性分析以Tris－HCl（0.1 mol·L－1，pH＝6）溶液為參比溶液，試驗(yàn)組溶液為：①槲皮素（20μL，1 mmol·L－1）＋DES（50μL，15 mmol·L－1）＋Tris－HCl（530μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）；②槲皮素（20μL，1 mmol·L－1）＋Tris－HCl（580μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）；③DES（50μL，15 mmol·L－1）＋Tris－HCl（550μL，0.1 mol·L－1，pH＝6）。使用2.3項(xiàng)下的方法，測(cè)試上述3種混合溶液的熒光發(fā)射光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，槲皮素、DES溶液均未有明顯的熒光發(fā)射，而槲皮素和DES的混合溶液具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是DES的共軛結(jié)構(gòu)兩端吸電子性的疊氮基被還原為給電子性的氨基，氨基的給電子能力提高了分子的最高占有軌道能級(jí)，能級(jí)間隙減小，使得溶液在紫外光照射下發(fā)出強(qiáng)烈的熒光［20］。因此基于槲皮素的抗氧化性與DES還原產(chǎn)物的熒光特性所建立的槲皮素含量測(cè)定方法是可行的。

圖1 可行性實(shí)驗(yàn)的熒光光譜圖

2.5 條件優(yōu)化

2.5.1 pH值優(yōu)化槲皮素結(jié)構(gòu)受pH值影響較大，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿條件下其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變［21］。在pH為4、5、6、7、8、9的條件下，分別測(cè)定反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。如圖2－A所示，pH值從4至6時(shí)溶液熒光強(qiáng)度逐漸增大，在pH＝6時(shí)溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度達(dá)到最大，當(dāng)pH值超過6時(shí)熒光強(qiáng)度逐漸減弱。因此選擇pH＝6的緩沖溶液進(jìn)行熒光測(cè)定。

2.5.2 時(shí)間優(yōu)化測(cè)試槲皮素和DES在反應(yīng)時(shí)間為5 min，10 min，15 min，20 min，25 min，30 min時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度。如圖2－B所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合溶液熒光強(qiáng)度在5～30 min內(nèi)幾乎不隨反應(yīng)時(shí)間而變化。選擇槲皮素與DES反應(yīng)5 min后測(cè)試溶液的熒光光譜。

3 槐米中槲皮素的含量測(cè)定

3.1 線性關(guān)系考察精密稱取槲皮素對(duì)照品適量，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解，配制0.25 mmol·L－1、0.5 mmol·L－1、0.75 mmol·L－1、1.00 mmol·L－1、2.00 mmol·L－1、4.00 mmol·L－1的槲皮素對(duì)照品溶液。根據(jù)2.3項(xiàng)下方法測(cè)試熒光光譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素濃度為0.25～4.00 mmol·L－1的范圍內(nèi)，溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度與槲皮素濃度的對(duì)數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程為Y＝104 119.79 X＋84 927.823（X代表槲皮素濃度的對(duì)數(shù)值，Y代表DES還原產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度），R2＝0.999 6。見圖3。

圖2 槲皮素測(cè)試條件優(yōu)化的熒光光譜圖

圖3 不同槲皮素溶液濃度對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度

3.2 共存物質(zhì)的影響常見的金屬陽(yáng)離子、銨根離子以及Glc（葡萄糖）可能會(huì)影響槲皮素檢測(cè)的準(zhǔn)確性［22］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在槲皮素濃度為1.00 mmol·L－1條件下，50倍濃度的K＋、Ca＋、Zn2＋、Mg2＋、NH4＋以及Glc對(duì)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度沒有明顯影響，表明該方法的選擇性良好。見圖4。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取5份槐米樣品，根據(jù)2.2項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照2.3項(xiàng)下的方法進(jìn)行熒光檢測(cè)。根據(jù)對(duì)照品線性回歸方程，得到樣品中槲皮素含量的平均值為0.1325 mg·g－1，RSD為2.2%，表明測(cè)定方法的重復(fù)性較好。

3.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取9份已知含量（槲皮素0.132 5 mg·g－1）的槐米粗粉，3份一組，分別按照0.8倍、1.0倍、1.2倍加樣量加入槲皮素對(duì)照品，按照2.2項(xiàng)下的方法制備待測(cè)樣品溶液。按照2.3項(xiàng)下的方法測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度，并根據(jù)線性方程計(jì)算出槲皮素含量的理論值，結(jié)果列于表1。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到槲皮素的平均回收率為98.47%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.51%（n＝9）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法符合定量分析的要求。

圖4 共存物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響的熒光光譜圖

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

4 結(jié)論

基于槲皮素的強(qiáng)抗氧化性與DES還原產(chǎn)物的熒光特性，對(duì)槐米中槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，體系的最佳pH值為6，在5～30 min內(nèi)槲皮素與DES混合溶液的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。在最佳條件下，槲皮素濃度為0.25～4.00 mmol·L－1時(shí)，槲皮素的濃度與還原態(tài)DES的熒光強(qiáng)度之間呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，檢測(cè)限為5.45×10－3mmol·L－1，R2＝0.999 6。常 見金屬離子（K＋、Ca＋、Zn2＋、Mg2＋），NH4＋和Glc對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯干擾。該方法操作簡(jiǎn)便，具有良好的抗干擾性、重現(xiàn)性，可為槐米藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。