木犀草素抑制ERK1／2與p38 MAPK的活化介導鼻咽癌CNE1細胞的生長、移動性和腫瘤干細胞樣特性*

陳進芬，劉平，陳靜，吳志勇，華清泉，王蘭

1.應城市人民醫(yī)院，湖北 應城432400；2.武漢大學人民醫(yī)院，湖北 武漢430000；3.武漢科技大學附屬醫(yī)院，湖北 武漢430000

鼻咽癌是一種位于鼻咽部的上皮惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)仍保持較高的發(fā)病率［1］。鼻咽癌具有局部侵襲和早期遠處轉(zhuǎn)移的特點，遺傳易感性、Epstein－Barr病毒（EBV）感染和環(huán)境因素是鼻咽癌的三大主要誘因［2］。目前，對于局部晚期的鼻咽癌，化學療法、放射療法無疑是標準的治療方法，可將病死率降低18%，并將5年總生存率提高4～6%［3］。雖然鼻咽癌對放療和化療很敏感，但由于其具有很高的轉(zhuǎn)移潛能，30～40%的鼻咽癌患者會在4年內(nèi)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，因此這些治療方法的有效性受到嚴重影響，這也是鼻咽癌治療失敗的主要原因［4］。減少復發(fā)和預防轉(zhuǎn)移是鼻咽癌成功治療的關鍵。目前鼻咽癌的病理分子機制尚不清楚，了解鼻咽癌的病理機制，尋找新的治療藥物是非常必要的。木犀草素是黃酮類化合物家族中的一員，通常以糖基化形式存在于草本植物木犀草中。木犀草素可直接誘導大量人類癌細胞凋亡［5－7］，并提高癌細胞對化療或生物治療藥物的敏感性［8］。大量研究表明，木犀草素具有抗腫瘤的潛力，但其對鼻咽癌的作用及確切潛在機制仍不清楚。本研究探索木犀草素對鼻咽癌CNE1細胞生長、運動和腫瘤干細胞樣特性的影響以及是否存在ERK1／2和p38 MAPK信號通路的參與，檢測該通路相關蛋白的表達情況，從而確定新的治療靶點，以期為木犀草素應用于鼻咽癌的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞CNE1細胞株（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，GDC0208），培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、B27、bFGF、EGF（美國Gibco公司，批號：11039021、12483020、15400054、12587010、13256－029、PHG0311）；RIPA裂解液（P0013HD，碧云天，上海）；二喹啉甲酸BCA蛋白濃度測定試劑盒（PA115，天根生物公司，北京）；5－ethynyl－2′－deoxyuridine（EdU）檢測試劑盒（C00053，銳博生物，廣州）；MatrigelTM底膜基質(zhì)（3356234，BD公司，美國）；Super RT cDNA試劑盒（CW0741M，康為世紀，北京）；Quantifast?SYBR?Green PCR Kit（204054，QIAGEN，德國）；Ki67、Bcl－2、Bax、Survivin、c－Myc、vascular endothelial growth factor（VEGF）、Vimentin、Fibronectin、ERK1／2抗體、p38 MAPK抗體（批號：ab92742、ab32124、ab182734、ab76424、ab32072、ab72807、ab16700、ab32419、ab17942、ab4822，Abcam公司，美國）；HRP標記的山羊抗小鼠以及羊抗兔二抗（批號：sc－2005、sc－2040，Santa Cruz公司，美國）；細胞凋亡檢測試劑盒（批號：KGA1016，南京凱基生物有限公司，中國）；木犀草素（批號：L9283，純度：98%，Sigma公司，美國）。

1.3 儀器高速低溫離心機（Beckman公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱、ABI 7500實時熒光定量PCR儀（Thermo公司，美國）；電泳槽、電轉(zhuǎn)儀（Bio－Rad公司，美國）；27145型低黏附6孔板（諾為生物，北京）；流式細胞儀（Beckman公司，美國）；電熱恒溫水浴箱（Grant公司，英國）；GDS－800凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司，美國）；ChemiDoc XRS凝膠／發(fā)光圖像分析儀（Bio－Rad公司，美國）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)CNE1細胞株在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中生長，當細胞匯合率達到80%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代，取3～8代細胞用于實驗。藥物干預前，將細胞調(diào)整至適當密度，接種于96孔、24孔或6孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至融合狀態(tài)，用1%低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h使細胞同歩化。

2.2 分組與給藥將CNE1細胞分4組處理：對照組：在細胞融合后，用含正常血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，換為無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；藥物處理組：在細胞融合后，用含低、中、高劑量（5、10、20 mg·L－1）木犀草素及正常血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，換為不加藥物的無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3 Ed U染色檢測細胞增殖狀態(tài)嚴格按照試劑盒說明書操作，具體如下：將處理過的各組細胞用50μmol·L－1的EdU培養(yǎng)12 h，用4%的多聚甲醛固定細胞30 min，然后用5%的甘氨酸孵育5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。0.5%Triton X－100破膜后，用抗－EdU抗體孵育30 min，再用5 mg·L－1Hoechst 33342染色30 min，熒光顯微鏡觀察并照相。

2.4 免疫印跡法檢測相關蛋白的表達使用裂解緩沖液裂解細胞樣品，并用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。含有20μg蛋白質(zhì)的10μL樣品在10%SDS－PAGE中分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗（Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc、VEGF、Vimentin、Fibronectin、ERK1／2、p－ERK1／2、p38 MAPK、p－p38 MAPK，1∶1 000）于4℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL，設置曝光參數(shù)，檢測目的條帶化學發(fā)光強弱。

2.5 Transwell檢測CNE1細胞的侵襲能力將木犀草素處理過的細胞消化離心，無血清培養(yǎng)基重懸細胞，以每孔1×104個細胞數(shù)量種入上室，下室加入有血清的培養(yǎng)基。48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細胞，將transwell小室倒置風干，并放入含有500μL染色液（0.1%結(jié)晶紫）的12孔板中，染色20 min，PBS清洗3次，風干。在transwell小室直徑上，取5個視野，在顯微鏡下拍照計數(shù)。

2.6 成球?qū)嶒灆z測腫瘤干細胞樣特性收集對數(shù)生長期的CNE1細胞，用DMEM培養(yǎng)基洗1次并重懸，血細胞計數(shù)器統(tǒng)計細胞密度。在低黏附6孔板中加2%B27、20μg·L－1bFGF和20μg·L－1EGF的DMEM培養(yǎng)基，每孔接種1 000個細胞，置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每隔2 d補加新鮮培養(yǎng)基，分別加藥處理14 d，于倒置顯微鏡下拍照并統(tǒng)計成球直徑和成球率。

2.7 RT－PCR檢測相關基因的mRNA表達使用TRIzol試劑提取總RNA，并通過超微紫外光分光光度計在260和280 nm處測定吸光度。按照試劑盒說明書，使用Super RT cDNA試劑盒合成cDNA。使用Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit進行PCR，分別在95℃15 s和60℃60 s條件下使用ABI 7500將反應激活。用于該反應的CD33、SOX－2、OCT4及β－actin的引物信息見表1。

2.8 統(tǒng)計學方法使用SPSS 21.0（SPSS，Inc，Chicago，IL，USA）分析所有數(shù)據(jù)。所有實驗至少獨立重復3次，每個獨立重復檢測3次。測量數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差。使用LSD方法進行成對比較，采用t檢驗比較兩組間符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 木犀草素抑制鼻咽癌CNE1細胞的增殖與對照組比較，中、高劑量木犀草素處理后，EdU紅色標記的細胞明顯減少，即增殖細胞占比減少。結(jié)果見圖1。

表1 RT－PCR的引物序列

圖1 鼻咽癌CNE1細胞的增殖變化（EdU染色，×400）

3.2 木犀草素抑制Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc的蛋白表達與對照組比較，低劑量組Ki67和Bcl－2／Bax蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），提示木犀草素可抑制鼻咽癌CNE1細胞中Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc蛋白的表達。結(jié)果見圖2，表2。

3.3 木犀草素抑制鼻咽癌CNE1細胞的侵襲能力

與對照組比較，中、高劑量的木犀草素處理后侵入到小室膜底側(cè)的CNE1細胞數(shù)量明顯減少，即侵襲性細胞數(shù)減少。結(jié)果見圖3。

表2 不同濃度木犀草素處理后Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc的蛋白表達 （±s）

表2 不同濃度木犀草素處理后Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc的蛋白表達 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

Myc／GAPDH／%對照組組別 Ki67／GAPDH／% Bcl－2／Bax Survivin／GAPDH／% c－23.26±3.05 6.93±0.92 14.21±2.54 18.06±3.25低劑量木犀草素組 19.41±5.46* 3.81±0.28* 14.02±1.93 16.32±3.84中劑量木犀草素組 6.26±1.03* 0.18±0.04* 5.19±1.22* 6.87±1.47*高劑量木犀草素組 3.85±1.64* 0.04±0.01* 1.28±0.58* 1.02±0.94*

圖3 不同濃度木犀草素處理后CNE1細胞侵襲能力的變化

3.4 木犀草素抑制VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表達與對照組比較，中、高劑量組VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4，表3。

3.5 木犀草素降低鼻咽癌干細胞特性與對照組比較，低、中、高劑量組腫瘤干細胞成球直徑和數(shù)目均顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果見圖5，表4。

表3 不同濃度木犀草素處理后VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表達 （±s）

表3 不同濃度木犀草素處理后VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表達 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 VEGF／GAPDH／%Vimentin／GAPDH／%Fibronectin／GAPDH／%對照組66.29±9.64 42.41±8.05 93.45±10.24低劑量木犀草素組 63.11±8.05 41.45±7.26 89.14±12.53中劑量木犀草素組 19.25±5.42*13.43±4.92*22.77±6.42*高劑量木犀草素組 7.17±3.19*10.15±3.67*16.84±5.17*

圖4 不同濃度木犀草素處理后VEGF、Vimentin、Fibronectin的蛋白表達

3.6 木犀草素抑制CD33、SOX－2、OCT4 mRNA的表達與對照組比較，低劑量組OCT4 mRNA表達量顯著降低（P＜0.05）；中、高劑量組CD33 mRNA、SOX－2 mRNA、OCT4 mRNA表達量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表4 不同濃度木犀草素處理后腫瘤干細胞成球體積和數(shù)目的變化 （±s）

表4 不同濃度木犀草素處理后腫瘤干細胞成球體積和數(shù)目的變化 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 成球直徑（l／μm）成球數(shù)目／100個細胞對照組128.64±19.06 87.29±16.41低劑量木犀草素組 95.31±12.85* 73.16±14.27*中劑量木犀草素組 28.14±6.93* 28.07±9.03*高劑量木犀草素組 10.27±4.62* 23.91±8.81*

表5 不同濃度木犀草素處理后CD33、SOX－2、OCT4的mRNA表達 （±s）

表5 不同濃度木犀草素處理后CD33、SOX－2、OCT4的mRNA表達 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 CD33 mRNA（2－ΔΔCt）SOX－2 mRNA（2－ΔΔCt）OCT4 mRNA（2－ΔΔCt ）對照組1 1 1低劑量木犀草素組0.93±0.07 0.94±0.06 0.82±0.08*中劑量木犀草素組0.61±0.03*0.58±0.03*0.44±0.06*高劑量木犀草素組0.25±0.04*0.23±0.05*0.13±0.02*

圖5 不同濃度木犀草素處理后腫瘤干細胞成球體積和數(shù)目的變化

3.7 木犀草素抑制ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化水平與對照組比較，低劑量組p－ERK1／2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；中、高劑量組p－ERK1／2和p－p38 MAPK蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖6，表6。

圖6 不同濃度木犀草素處理后ERK1／2和p38 MAPK磷酸化水平的變化

表6 不同濃度木犀草素處理后ERK1／2和p38 MAPK磷酸化水平的變化 （±s）

表6 不同濃度木犀草素處理后ERK1／2和p38 MAPK磷酸化水平的變化 （±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

p－ERK1／2／ERK1／2 p－p38 MAPK／p38 MAPK對照組組別0.88±0.05 0.36±0.05低劑量木犀草素組 0.69±0.06* 0.35±0.04中劑量木犀草素組 0.14±0.02* 0.07±0.03*高劑量木犀草素組 0.08±0.03* 0.02±0.01*

4 討論

鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮的腫瘤，常發(fā)生在鼻咽部咽隱窩和頂前壁部位，是我國南部和東南亞地區(qū)最常見的頭頸部惡性腫瘤之一。鼻咽癌浸潤生長快，惡性程度高，且其解剖部位特殊，早期病灶小，癥狀不典型，臨床上易忽略及誤診，發(fā)病早期就可能發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至遠處轉(zhuǎn)移［9］。放療是主要的治療手段，但目前放射療法和化學療法不能完全根除腫瘤［10］。鼻咽癌放療后局部復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是制約其療效，影響其預后的主要原因［11］。因此，研究鼻咽癌的分子機理，尋找新的鼻咽癌治療方法已成為鼻咽癌防治的關鍵所在。

抑制細胞生長和誘導細胞死亡是抑制腫瘤生長的兩種主要手段［12］。細胞凋亡對于維持組織穩(wěn)態(tài)和預防癌癥發(fā)展至關重要［13］。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過下調(diào)Bcl－2和Survivin蛋白的表達，上調(diào)Bax蛋白的表達，以劑量依賴性的方式有效抑制骨肉瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡［14］。木犀草素抑制過表達cMet的PDTX模型腫瘤生長，誘導細胞凋亡，并顯著下調(diào)MMP9、Ki－67和cMet的表達［15］。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以抑制Eca109的增殖，下調(diào)c－Myc的mRNA水平，降低c－Myc在Eca109細胞中的蛋白表達。與前人研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可抑制CNE1的增殖，下調(diào)Ki67、Bcl－2／Bax、Survivin、c－Myc蛋白表達水平，表明木犀草素能促進鼻咽癌CNE1細胞的凋亡，抑制其生長。

癌癥具有高侵襲轉(zhuǎn)移潛能，這是導致治療失敗的主要原因［17］。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素對CAOV3／DDP細胞的侵襲具有劑量依賴性的抑制作用［18］。Zang等［19］通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，木犀草素處理可顯著抑制胃癌細胞的侵襲，間質(zhì)生物標志物Vimentin的蛋白水平呈劑量依賴性降低。研究證實在木犀草素處理后，Vimentin和VEGF的蛋白水平均明顯降低，抑制結(jié)直腸癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［20］。同樣，木犀草素能夠抑制U87細胞的侵襲，抑制人膠瘤細胞對Fibronectin的黏附［21］。與之前的研究結(jié)果相似，本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素抑制鼻咽癌CNE1細胞的侵襲，顯著下調(diào)VEGF、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平，表明木犀草素具有抑制鼻咽癌CNE1細胞侵襲和運動的作用。

鼻咽癌腫瘤干細胞能產(chǎn)生異質(zhì)腫瘤細胞，具有很強的自我更新能力，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與鼻咽癌的耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關。Wang等［22］使用Hoechst 33342從NPC細胞系CNE－2中分選出的側(cè)群細胞具有干細胞特性，對體內(nèi)和體外的化學療法和放射療法具有抗性。研究發(fā)現(xiàn)，給予mTOR信號抑制劑后，mTOR信號激活被抑制，CD133、SOX2、OCT4表達減少，雷帕霉素處理后，鼻咽癌腫瘤干細胞樣活性被抑制［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能夠明顯抑制在成球?qū)嶒炛蠧NE1的成球能力，降低其中腫瘤干細胞的比例，下調(diào)CD33 mRNA、SOX－2 mRNA、OCT4 mRNA的表達量，表明木犀草素能降低鼻咽癌腫瘤干細胞活性。

ERK1／2和p38 MAPK信號通路在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。Shen等［24］研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK和ERK1／2磷酸化水平的降低參與了木犀草素介導的UPEC入侵抑制，木犀草素預處理細胞可明顯抑制p38 MAPK和ERK1／2的激活。木犀草素在EGF誘導的MCF－7乳腺癌細胞中具有抑制MAPK和p－ERK1／2信號通路活性的潛力［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素明顯降低ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化水平，推測木犀草素可通過抑制ERK1／2和p38 MAPK的活性抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，木犀草素可抑制鼻咽癌CNE1細胞的生長和運動，降低鼻咽癌干細胞樣特性，其機制可能與抑制ERK1／2和p38 MAPK的磷酸化有關。