基于LC－MS／MS研究補(bǔ)腎化瘀生新方在大鼠體內(nèi)的入血成分*

劉雪曼，張金生，張寶霞

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州450008；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000

補(bǔ)腎化瘀生新方由熟地黃、巴戟天、川芎、當(dāng)歸、石斛、肉桂、甘草等7味中藥組成，具有補(bǔ)腎活血、化瘀生新的功效。前期研究表明，補(bǔ)腎化瘀生新方協(xié)同靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可延緩衰老，有抗衰防衰的作用［1］，其延緩細(xì)胞衰老的作用可能與降低β－半乳糖苷酶活性、激活端粒酶活性、提高BMSCs增殖分化能力有關(guān)［2］。

中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜多樣，認(rèn)為被吸收入血的成分有可能產(chǎn)生藥效［3－4］。本文在前期研究基礎(chǔ)上，采用血清藥物化學(xué)研究方法，應(yīng)用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS／MS）技術(shù)分析補(bǔ)腎化瘀生新方的吸收入血成分，以期探討其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用。

1 材料

1.1 動物SPF級SD大鼠40只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購于河南省實驗動物中心，動物合格證號：41003100006978。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗動物中心，溫度18～22℃，濕度30%～60%，明暗周期各12 h，自由采食、飲水。本實驗經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并按照相關(guān)要求嚴(yán)格執(zhí)行，倫理批號：DWLL2018030051。

1.2 藥物與試劑補(bǔ)腎化瘀生新方：熟地黃12 g（批號：181101）、巴戟天10 g（批號：181001）、肉桂3 g（批號：180801）、石斛10 g（批號：180801）、川芎15 g（批號：180801）、當(dāng)歸12 g（批號：181101）、甘草3 g（批號：181001），上述中藥均購于安徽三義堂中藥飲片有限公司，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院崔瑛教授鑒定。對照品：阿魏酸（批號：CHB180206）、梓醇（批 號：CHB181129）、地 黃 苦 苷（批 號：CHB180129）、大黃素甲醚（批號：CHB180730）、黃芩苷（批號：CHB190115）、甲基異茜草素（批號：CHB190120），純度均≥98%，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，貨號：A452－4）；甲酸（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司，貨號：85174）。

1.3 儀器Orbitrap Fusion、Xcalibur質(zhì)譜工作站、SPD2010－230 SpeedVac離心濃縮儀、Heraeus Multifuge X1R型高速臺式冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific公司）；BE－3100型超級混勻小精靈（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；XH－C旋渦混合器（金壇市國旺實驗儀器廠）；十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli－Q處理純凈水（Millipore公司）；Thermo Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；Mass Frontier 6.0工作站。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 補(bǔ)腎化瘀生新方溶液的制備熟地黃、巴戟天、當(dāng)歸、川芎、肉桂、石斛、甘草等7味中藥，加12倍量水煎煮提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液，濃縮，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備取阿魏酸、黃芩苷、梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚各對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，定容配置成0.01 g·L－1的對照品溶液備用。

2.2 動物給藥與含藥血清樣品采集將40只大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組20只。根據(jù)前期實驗結(jié)果［2］，給藥組以122.9 g·kg－1的劑量給大鼠灌胃補(bǔ)腎化瘀生新方，空白組灌胃等體積的蒸餾水，早晚各1次，連續(xù)給藥7 d，第7天下午末次給藥后麻醉，腹主動脈取血，室溫靜置30 min后，離心半徑12 cm、3 500 r·min－1離心15 min，取 血 清，用0.22μm過濾器無菌過濾，標(biāo)記，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血清樣本的處理血清樣品置于室溫下解凍后，取100μL血清樣品，加入3倍量的甲醇，渦旋30 s，1 500 r·min－1混懸10 min，12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，45℃下干燥2 h，殘渣用200μL甲醇復(fù)溶，渦旋30 s，1 500 r·min－1離心10 min，取上清，12 000 r·min－1離心10 min，取上清，進(jìn)樣分析。

2.4 質(zhì)譜與色譜條件

2.4.1 質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI），DMSS2模式，正、負(fù)離子分別掃描，掃描范圍：m／z 120～1200。噴霧電壓3 500（＋）／2 500（－）伏，離子傳輸管溫度300℃，自動增益控制目標(biāo)：4.0e5，最大注入時間50 ms。

2.4.2 色譜條件Thermo Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm），以甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）為流動相，流速0.2 mL·min－1，梯度洗脫（0.00～5.00 min 95%→55%B，5.00～14.00 min 55%→37%B，14.00～26.00 min 37%→10%B，26.00～34.00 min 10%→0%B，34.00～35.00 min 0%B），柱溫30℃，進(jìn)樣量5μL，檢測波長254 nm。

2.5 補(bǔ)腎化瘀生新方中入血成分的鑒定應(yīng)用LC－MS／MS技術(shù)，對大鼠灌胃補(bǔ)腎化瘀生新方后的含藥血清、空白血清及對照品溶液進(jìn)行對比分析，應(yīng)用Xcalibur軟件以精確m／z提取離子峰以確定保留時間，運用Mass Frontier 6.0工作站匹配特征碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)相關(guān)信息，鑒別化合物結(jié)構(gòu)，確定入血成分。

2.6 補(bǔ)腎化瘀生新方中入血成分的濃度測定取阿魏酸、黃芩苷、梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚各對照品溶液適量，按一定比例用甲醇由高到低配制成6個濃度梯度的混合對照品溶液，分別進(jìn)樣分析，記錄對應(yīng)峰面積，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品濃度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法使用Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納、整理，應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行線性回歸分析。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎化瘀生新方入血成分的鑒定最終鑒定出補(bǔ)腎化瘀生新方的入血成分6個，見表1。其中來源于熟地黃的化學(xué)成分2個，分別是地黃苦苷、梓醇；來源于巴戟天的化學(xué)成分2個，分別是大黃素甲醚、甲基異茜草素；來源于當(dāng)歸的化學(xué)成分為黃芩苷；阿魏酸主要來源于當(dāng)歸或川芎；其中代表性成分地黃苦苷、大黃素甲醚提取離子流色譜圖，見圖1。

表1 6個化學(xué)成分鑒定結(jié)果

3.2 測定補(bǔ)腎化瘀生新方在大鼠體內(nèi)的入血成分濃度經(jīng)LC－MS／MS分析，補(bǔ)腎化瘀生新方入血成分中阿魏酸、黃芩苷、梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚6個化學(xué)成分的濃度。見表2。

圖1 對照品（a）、含藥血清（b）的代表性成分LC－MS／MS色譜圖

表2 6個化學(xué)成分體內(nèi)濃度

4 討論

中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的核心問題［5－6］，因中藥復(fù)方所含化學(xué)成分復(fù)雜多樣，其所屬化學(xué)成分并非復(fù)方內(nèi)單味藥物化學(xué)成分的簡單組合，而是復(fù)方中各味中藥間共同作用的結(jié)果。補(bǔ)腎化瘀生新方由7味中藥組成，所含化學(xué)成分繁雜。本實驗采用血清藥物化學(xué)研究方法，應(yīng)用LC－MS／MS技術(shù)分析空白血清與含藥血清，快速分離并尋找藥物入血成分，通過對入血成分進(jìn)行分析最終確定梓醇、地黃苦苷、甲基異茜草素、大黃素甲醚、黃芩苷、阿魏酸6個化合物為補(bǔ)腎化瘀生新方大鼠體內(nèi)吸收入血成分。

藥理研究表明，阿魏酸通過刺激血管內(nèi)皮生長因子、PDGF和HIF－1α顯示出血管生成活性，其血管生成作用可通過調(diào)控MAPK和PI3K途徑發(fā)生，是缺血性疾病的潛在新治療劑［7－9］。低濃度的阿魏酸通過上調(diào)SIRT1、SIRT7和MDM2蛋白表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、增殖作用，高濃度的阿魏酸可誘導(dǎo)神經(jīng)分化和神經(jīng)突起生長［10］。地黃苦苷對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制過氧化亞硝酸鹽介導(dǎo)的有絲分裂激活有關(guān)［11］。黃芩苷可抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)線粒體、促進(jìn)神經(jīng)元保護(hù)因子表達(dá)、抑制細(xì)胞凋亡和壞死，從而發(fā)揮對腦缺血大鼠的腦保護(hù)作用［12－15］。梓醇可抑制腫瘤壞死因子－α、白細(xì)胞介素－6的水平，從而改善機(jī)體微炎癥狀態(tài)［16］，通過上調(diào)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其基因的表達(dá)，促進(jìn)缺血性病灶周圍神經(jīng)元軸突生長，使芽生軸突形成新的突觸連接，增強(qiáng)突觸結(jié)構(gòu)可塑性，從而促進(jìn)神經(jīng)元存活、修復(fù)再生，加速神經(jīng)功能恢復(fù)［17－18］。研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋穩(wěn)態(tài)、降低線粒體損傷、抑制ERK1／2和PARP－1激活進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞免受缺血缺氧性損傷，具有延緩衰老作用［19－21］。甲基異茜草素通過抑制破骨細(xì)胞的形成、分化和骨吸收功能來減少骨質(zhì)丟失［22－23］，另還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用［24］。研究發(fā)現(xiàn)，腎精不足小鼠與腫瘤小鼠的基因表達(dá)譜存在相似性，主要體現(xiàn)在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及細(xì)胞功能等，這為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎填精法治療癌癥提供了借鑒［25］。巴戟天具有補(bǔ)腎陽、壯筋骨、祛風(fēng)濕功效，其中有效成分大黃素甲醚具有廣泛抗癌作用［26］，可抑制多種癌細(xì)胞系的生長，如鼻咽癌、肝癌、乳腺癌等，作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬、阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)［27－30］。

經(jīng)與文獻(xiàn)對比及前期化學(xué)成分研究，認(rèn)為6個入血成分主要來源于熟地黃、巴戟天、當(dāng)歸、川芎，提示這4味中藥可能對補(bǔ)腎化瘀生新方在體內(nèi)發(fā)揮藥效起主要作用。6個化合物分屬于環(huán)烯醚萜苷類、蒽醌類、黃酮類及有機(jī)酸類，提示這些成分可能是該方發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中，課題組將會進(jìn)一步探討入血成分的生物活性，以便更好地探究補(bǔ)腎化瘀生新方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。