Na+、 K+、Ca2+、葡萄糖、pH、溫度對(duì)北方須鰍精子活力的影響

韓峰，駱小年，段友健，羅超，繆云亮，曾永聰

(大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

北方須鰍Barbatulabarbatulanuda隸屬于鯉形目Cypriniformes鰍科Cobitidae須鰍屬Barbatula，是中國(guó)北方地區(qū)溪流中常見(jiàn)的小型底棲魚(yú)類(lèi)。在國(guó)外，主要分布于俄羅斯、日本、朝鮮等地；在中國(guó)，除東北地區(qū)外，主要分布于灤河、海河上游、新疆額爾齊斯河、烏倫古河等[1]。北方須鰍肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。目前，由于酷漁濫捕和環(huán)境改變，北方須鰍自然資源日趨枯竭，因此，開(kāi)展其規(guī)?；斯し敝澈宛B(yǎng)殖研究具有重要意義[2-3]。

魚(yú)類(lèi)的精子質(zhì)量受雄親魚(yú)的健康狀況、年齡、體型、性腺發(fā)育程度等影響。精子活力是衡量精子質(zhì)量的重要指標(biāo)[4-7]，激活液中離子濃度、葡萄糖濃度、pH、溫度等因子均可影響精子活力[8]。目前，北方須鰍的規(guī)?；斯し敝橙匀灰蕾囉谌斯な诰虼?，對(duì)其精子活力研究顯得尤為重要，但尚未見(jiàn)有關(guān)北方須鰍精子活力的研究報(bào)道。本研究中，通過(guò)觀察北方須鰍精子活力與離子濃度、葡萄糖濃度、pH、溫度等因子間的關(guān)系，初步確定了北方須鰍精子激活與離子、葡萄糖、pH、溫度等因子的適宜條件，旨在有效解決現(xiàn)階段北方須鰍人工繁育中精子活力較低的問(wèn)題，為其人工繁育提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年4月17日從遼寧省桓仁滿族自治縣木盂子鎮(zhèn)某漁場(chǎng)，挑選健康、性腺成熟度好的雄魚(yú)27尾，體長(zhǎng)為10～15 cm，體質(zhì)量為10～38 g，暫養(yǎng)于水泥池中供試驗(yàn)用。

1.2 方法

1.2.1 催產(chǎn)及精液采集 采用促黃體生成素釋放激素類(lèi)似物(LHRH-A2)復(fù)合型藥物，對(duì)魚(yú)體進(jìn)行背鰭基部肌肉注射后再放入暫養(yǎng)池，水溫漸升至20.0 ℃，24 h后用潔凈毛巾包裹住魚(yú)體，用吸水紙擦干泄殖孔周?chē)郑p壓魚(yú)體下腹部，采得無(wú)血、無(wú)糞便的精液于載玻片上備用。

1.2.2 精子激活試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考張濤等[9]關(guān)于高體雅羅魚(yú)Leuciscusidus精子活力試驗(yàn)方法并加以改進(jìn)，設(shè)計(jì)不同因子及其不同濃度對(duì)北方須鰍精子活力的影響試驗(yàn)。

單因子試驗(yàn)：NaCl濃度分別設(shè)為17、51、68、85、94、102 mmol/L；KCl濃度分別設(shè)為5、10、20、50、80、100 mmol/L；CaCl2濃度分別設(shè)為10、30、50、80、100 mmol/L；Tris(C4H11NO3)濃度分別設(shè)為2、8、16、20、24、33、198 mmol/L；甘油(C2H5NO2)濃度分別設(shè)為13、26、30、41、56 mmol/L；葡萄糖濃度分別設(shè)為10、30、60、90、150、180 mmol/L；用去離子水作空白對(duì)照組。

復(fù)合因子試驗(yàn)：在單因子試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)復(fù)合因子試驗(yàn)，設(shè)置混合激活液A(Na+68 mmol/L、K+80 mmol/L 2種離子溶液的體積比為1∶1)和激活液B(Na+68 mmol/L、K+80 mmol/L、Ca2+50 mmol/L、葡萄糖180 mmol/L 4種離子溶液的體積比為1∶1∶1∶1)。

每種離子濃度及混合激活液均設(shè)置3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。除溫度為因變量的試驗(yàn)組外，其他因子試驗(yàn)組的溫度均為室溫20 ℃。

不同pH、溫度梯度設(shè)計(jì)均參考阮國(guó)良等[8]進(jìn)行的泥鰍精子活力試驗(yàn)設(shè)計(jì)。用離子濃度均為0.1 mol/L的KH2PO4、NaOH和H3BO3溶液配制出不同pH梯度的緩沖液[10]，pH分別設(shè)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0， 其中，pH 7.0為對(duì)照組，每個(gè)pH設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

將去離子水、北方須鰍精液及玻片等放入燒杯且密封后置于熱水浴鍋或冰水浴鍋中調(diào)節(jié)溫度，溫度分別設(shè)為(5.0±1.0)、(10.0±1.0)、(14.0±1.0)、(16.0±1.0)、(20.0±1.0)、(25.0±1.0)、(28.0±1.0)℃等，其中，溫度為(20.0±1.0)℃為對(duì)照組,每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.3 精子活力觀察 用解剖針挑取少量精液于載玻片上，滴一滴激活液，并迅速蓋上蓋玻片，置于顯微鏡(Olympus CX21)下觀察，同時(shí)用秒表計(jì)時(shí)，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.4 精子活力評(píng)價(jià)指標(biāo)

快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間(fast movement time，F(xiàn)T)：精子呈現(xiàn)快速運(yùn)動(dòng)，快到運(yùn)動(dòng)過(guò)程看不清路線，只能看到精子呈現(xiàn)“一團(tuán)旋渦”的持續(xù)時(shí)間。

壽命時(shí)間(life time，LT)：從精子開(kāi)始活動(dòng)至大約90%精子死亡的時(shí)間。

精子激活率：指激活起始時(shí)，視野中被激活的精子數(shù)量占全部精子數(shù)量的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，運(yùn)用 Excel 2016進(jìn)行處理。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na+對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表1可見(jiàn)：在Na+濃度為17～94 mmol/L 的溶液中，隨著Na+濃度的升高北方須鰍精子活力逐漸增強(qiáng)；Na+濃度為68 mmol/L時(shí)，精子活力最強(qiáng)，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間為(77±23)s，壽命為(495±15)s，激活率為95%，該濃度下的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間除與85 mmol/L濃度組無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，顯著快于其他組P<0.05),且壽命顯著高于其他組(P<0.05)；當(dāng)Na+濃度增加至94 mmol/L時(shí)，精子活力驟然下降。

表1 北方須鰍精子在不同濃度Na+溶液中的活力

2.2 K+對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表2可見(jiàn)：在K+離子濃度為5～100 mmol/L 的溶液中，北方須鰍精子活力隨K+濃度的升高而增強(qiáng)；K+濃度為80 mmol/L時(shí)，精子活力最強(qiáng)，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命和激活率分別為(68±10)s、(412±162)s和95%，該濃度下的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間除與100 mmol/L濃度組無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，顯著高于其他組(P<0.05)，且壽命顯著高于其他組(P<0.05)；當(dāng)K+濃度超過(guò)80 mmol/L時(shí)，精子活力下降。

表2 北方須鰍精子在不同濃度K+溶液中的活力情況

2.3 Ca2+對(duì)北方須鰍精子活力的影響

由表3可見(jiàn)：在Ca2+濃度為10～100 mmol/L的溶液中，北方須鰍精子活力隨Ca2+濃度的升高而增強(qiáng)；Ca2+濃度為50 mmol/L時(shí)，精子活力達(dá)到峰值，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命和激活率分別為(77±13)s、(281±26)s和95%，該濃度下的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間除與80 mmol/L濃度組無(wú)顯著性差異(P<0.05)外，顯著高于其他組(P<0.05)，且壽命顯著高于其他組(P<0.05)；當(dāng)Ca2+濃度超過(guò)50 mmol/L后，精子活力驟然下降。

表3 北方須鰍精子在不同濃度Ca2+溶液中的活力

2.4 Tris對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表4可見(jiàn)：在Tris濃度為2～198 mmol/L的溶液中，北方須鰍精子活力隨著Tris濃度的升高無(wú)顯著性變化，與對(duì)照組相比，加入Tris后精子活力減弱，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命均降低，精子激活率無(wú)明顯變化；Tris濃度為0 mmol/L的空白組精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間與其他濃度組間有顯著性差異(P<0.05),且壽命除與濃度為198 mmol/L組無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，均顯著高于其他濃度組(P<0.05)。這表明，加入Tris溶液后精子活力減弱。

表4 北方須鰍精子在不同濃度Tris溶液中的活力

2.5 甘油對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表5可見(jiàn)：在甘油濃度為13～56 mmol/L的溶液中，北方須鰍精子活力隨著濃度的升高而減弱，與對(duì)照組相比，加入甘油后精子活力減弱，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命、精子激活率均降低；甘油濃度為0 mmol/L的空白組精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間與26、56 mmol/L濃度組間有顯著性差異(P<0.05)，與其他濃度組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且壽命僅與26 mmol/L濃度組間有顯著性差異(P<0.05)。這表明，加入甘油溶液后精子活力減弱。

表5 北方須鰍精子在不同濃度甘油溶液中的活力

2.6 葡萄糖對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表6可見(jiàn)：當(dāng)葡萄糖濃度為180 mmol/L時(shí)，北方須鰍精子活力最強(qiáng)，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命及激活率分別為(88±11)s、(272±34)s、90%，該濃度下的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著高于其他組(P<0.05)，且壽命除與150 mmol/L濃度組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，均顯著高于其他組(P<0.05)；當(dāng)葡萄糖濃度低于180 mmol/L時(shí)，隨著葡萄糖濃度的增加，精子活力逐漸升高。

表6 北方須鰍精子在不同濃度葡萄糖溶液中的活力

2.7 pH對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表7可見(jiàn)：當(dāng)pH為3.0～5.0時(shí)，北方須鰍精子完全不運(yùn)動(dòng)，精子活力受到抑制；當(dāng)pH為6.0～7.0時(shí)，精子活力隨著pH的上升而增強(qiáng)；當(dāng)pH為7.0時(shí)活力最強(qiáng)，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命及激活率分別為(87±11)s、(128±17)s、90%，該pH條件下的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間除與pH為8.0組無(wú)顯著性差異(P>0.05)外，顯著高于其他組(P<0.05)，且壽命與其他各組均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；之后，隨著pH的增大，精子活力逐漸減弱。這表明，精子在中性或弱堿性環(huán)境中活力更強(qiáng)。

表7 北方須鰍精子在不同pH溶液中的活力

2.8 溫度對(duì)北方須鰍精子活力的影響

從表8可見(jiàn)：當(dāng)溫度在5～20 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，北方須鰍精子活力變化不明顯，當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)，隨著溫度的升高精子活力明顯減弱；溫度為5～28 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，精子激活率變化不明顯；溫度為(5.0±1.0)℃時(shí)，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均顯著高于(25.0±1.0)、(28.0±1.0)℃組(P<0.05)。這表明，北方須鰍精子在溫度為5～20 ℃時(shí)活力較強(qiáng)。

表8 北方須鰍精子在不同溫度溶液中的活力

2.9 兩種混合激活液對(duì)北方須鰍精子活力影響

從表9可見(jiàn)：在混合激活液A中北方須鰍精子活力強(qiáng)于對(duì)照組，其精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命、精子激活率分別為(91±16)s、(552±90)s、95%，精子活力強(qiáng)于其他單一溶質(zhì)試驗(yàn)組；在混合激活液B中精子活力最強(qiáng)，快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間、壽命、精子激活率分別為(112±17)s、(707±60)s、95%，精子活力強(qiáng)于激活液A及其他單一溶質(zhì)試驗(yàn)組，激活液B中的精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間與激活液A無(wú)顯著性差異(P>0.05)，二者均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，激活液B中的精子壽命最長(zhǎng)，顯著長(zhǎng)于其他組(P<0.05)。這表明，加入混合激活液后，精子存活率明顯增強(qiáng)。

表9 北方須鰍精子在不同種類(lèi)混合激活液中的活力

3 討論

3.1 離子濃度對(duì)精子活力的影響

研究表明，多數(shù)魚(yú)類(lèi)的精子在輸精管和精漿中是不運(yùn)動(dòng)的，但在不同種類(lèi)的魚(yú)中，精子在釋放前處于靜止?fàn)顟B(tài)的原因各不相同[12-14]。如在鯉科魚(yú)類(lèi)[15-17]中，精子是通過(guò)較高的精漿滲透壓維持靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)精子從精漿到激活液或淡水中時(shí)，質(zhì)膜電位及其電導(dǎo)特性發(fā)生變化，精子從靜止?fàn)顟B(tài)變成了運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，這是由于細(xì)胞內(nèi)離子的變化導(dǎo)致一些參數(shù)變動(dòng)，如離子組成發(fā)生了改變，從而改變了細(xì)胞膜的性質(zhì)并誘導(dǎo)精子運(yùn)動(dòng)，而當(dāng)精子被激活開(kāi)始進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，其自身儲(chǔ)存的能量隨著時(shí)間的推移逐漸被消耗殆盡，最終停止運(yùn)動(dòng)。

黃辯非等[18]認(rèn)為，精子活力與所處環(huán)境的滲透壓有關(guān)。滲透壓對(duì)精子活力的影響實(shí)質(zhì)是各種離子的濃度對(duì)精子的影響。當(dāng)環(huán)境滲透壓與精子本身滲透壓相等時(shí)，精子活力最強(qiáng)，即快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命達(dá)到最大值，滲透壓高于或低于精子自身的滲透壓時(shí)，精子活力均會(huì)受到不同程度的抑制。在影響精子活力的各種因素當(dāng)中，滲透壓是影響精子活力的最關(guān)鍵因素[19-20]。一般情況下，低滲透壓環(huán)境能夠激活淡水硬骨魚(yú)類(lèi)精子，滲透壓適宜時(shí)精子活力強(qiáng)[21]。本研究表明，當(dāng)Na+、K+、Ca2+濃度分別為68、80、50 mmol/L時(shí)，北方須鰍精子活力較強(qiáng)，以上相關(guān)數(shù)據(jù)可作為北方須鰍人工繁殖中人工授精適宜激活液配制參考。

3.2 葡萄糖、甘油、Tris對(duì)精子活力的影響

硬骨魚(yú)類(lèi)精液中存在葡萄糖、半乳糖、果糖等糖類(lèi)物質(zhì)，這些糖類(lèi)物質(zhì)在提高精子活力方面具有重要作用[22-24]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，白斑狗魚(yú)Esoxlucius[25]、凹目白鮭Coregonusautumnalis[26]、丁鱥Tincatinca[27]和高體雅羅魚(yú)[9]等魚(yú)類(lèi)精子處于合適濃度的葡萄糖溶液中能夠有效提高其精子活力。這可能是在適宜濃度的葡萄糖激活液中精子能夠直接利用外源性葡萄糖，補(bǔ)充在激活時(shí)調(diào)節(jié)滲透壓和運(yùn)動(dòng)所消耗的能量[28-29]。有學(xué)者認(rèn)為，甘油對(duì)高體部分魚(yú)類(lèi)的精子活力具有增強(qiáng)效果，其作用甚至不低于葡萄糖[18，23]。此外，Tris常被用作低溫環(huán)境下精液的保存劑[30]。本研究表明，當(dāng)激活液中葡萄糖濃度為180 mmol/L時(shí)，北方須鰍精子的快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均達(dá)到最大值，且葡萄糖提升精子活力的效果優(yōu)于其他物質(zhì)，這與對(duì)泥鰍Misgurnusanguillicaudatus[28]和江鱈Lotalota精子活力的試驗(yàn)結(jié)果一致[29]。但本研究中甘油與Tris對(duì)北方須鰍精子活力具有抑制作用，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命均不如空白組對(duì)照，這兩種物質(zhì)對(duì)北方須鰍精子活力的影響機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

3.3 pH對(duì)精子活力的影響

pH也是影響精子活力的重要因素之一。王芳等[31]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)魚(yú)類(lèi)精漿的pH為弱堿性，精子處于中性或弱堿性環(huán)境中活力更強(qiáng)，在酸性環(huán)境中精子因細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損而失去活力或活力減弱，受精率降低[32]。羅明坤等[33]研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍、薩羅羅非魚(yú)Sarotherodonmelanotheron、翹嘴紅鲌Erythroculterilishaeformis和草魚(yú)Ctenopharyngodonidella等淡水魚(yú)類(lèi)精子在激活液pH 7.5以上時(shí)活力較強(qiáng)。本研究中，北方須鰍精子在pH在5.0以下時(shí)不運(yùn)動(dòng)，pH在7.0時(shí)精子活力最強(qiáng)，pH為7.0～8.0時(shí)精子活力較強(qiáng)，精子在中性或弱堿性環(huán)境中活力優(yōu)于弱酸性環(huán)境，這與對(duì)其他淡水魚(yú)類(lèi)的研究結(jié)果相似(表10)。

表10 北方須鰍及其他幾種淡水魚(yú)類(lèi)精子適宜pH范圍

3.4 溫度對(duì)精子活力的影響

溫度對(duì)精子活力的影響比較復(fù)雜，一般認(rèn)為，溫度與精子活力是一個(gè)開(kāi)口向下的二次函數(shù)關(guān)系[35]，溫度可能是通過(guò)改變精子酶的活性影響其活力。在一定范圍內(nèi)溫度升高時(shí)酶活性增強(qiáng)，精子的代謝速率加快，其快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間與強(qiáng)度也增加，但精子本身能量迅速消耗殆盡死亡，存活時(shí)間變短。當(dāng)溫度降低時(shí)，酶活性降低，精子代謝速率減慢，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間和強(qiáng)度也減弱，但精子運(yùn)動(dòng)消耗能量也減少，因此，存活時(shí)間延長(zhǎng)。即在一定溫度范圍內(nèi)(不同種魚(yú)類(lèi)間有差異)，隨著溫度的升高精子活力增強(qiáng)至峰值，達(dá)到峰值后，隨著溫度的升高精子活力逐漸減弱直至完全失活[36-38]。本研究中，溫度為5～20 ℃時(shí)，隨著溫度的上升，北方須鰍精子活力較高但變化不顯著。這可能是因?yàn)榇藴囟确秶c其生存和繁殖的適宜溫度相符，精子對(duì)溫度變化的耐受性較強(qiáng)。當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)，北方須鰍精子活力隨著溫度的升高顯著減弱。這是否說(shuō)明北方須鰍精子中酶活性的適宜溫度為5～20 ℃，還有待進(jìn)一步研究。

3.5 復(fù)合因子對(duì)精子活力的影響

本研究表明，不同離子對(duì)精子活力的影響各不相同，單因子試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Na+、K+、Ca2+及葡萄糖均對(duì)北方須鰍精子活力有增強(qiáng)作用。本研究中將不同離子溶液進(jìn)行組合，以進(jìn)一步探究其不同離子間的相互作用關(guān)系，結(jié)果如表11所示，其中Na+、K+離子溶液組成的激活液A相比于單一離子溶液對(duì)精子具有更強(qiáng)的激活作用，表明Na+和K+之間具有協(xié)同作用，由Na+、K+、Ca2+、葡萄糖組成的激活液B相比于單一離子溶液和激活液A對(duì)精子具有更強(qiáng)的激活作用，這表明Na+、K+、Ca2+、葡萄糖間也具有協(xié)同作用。由此可見(jiàn)，激活液B對(duì)增強(qiáng)北方須鰍精子活力的影響最大。由于涉及影響精子活力的物質(zhì)較多，不同組合也較多，激活液B是否為最佳激活液還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

表11 不同激活液對(duì)北方須鰍精子活力影響的比較

4 結(jié)論

1)Na+、K+、Ca2+、葡萄糖對(duì)北方須鰍精子活力有增強(qiáng)效果，且其組合激活液B(Na+68 mmol/L、K+80 mmol/L、Ca2+50 mmol/L、葡萄糖180 mmol/L 4種離子溶液的體積比為1∶1∶1∶1)效果最佳。

2) 北方須鰍精子的適宜溫度為5～20 ℃，適宜pH為7.0～8.0。本研究結(jié)果可有效解決現(xiàn)階段北方須鰍人工繁育中精子活力較低的問(wèn)題。