魚類抗病育種研究進(jìn)展

周欣，高風(fēng)英，盧邁新*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380; 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

近年來(lái)，魚類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展穩(wěn)定，2019年中國(guó)水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到5 079.07萬(wàn)t，魚類占到2 708.61萬(wàn)t，其中，海水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量160.58萬(wàn)t，淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量2 548.03萬(wàn)t，養(yǎng)殖面積達(dá)711萬(wàn)hm2[1]。根據(jù)2018年聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織發(fā)布的報(bào)告，隨著經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，人們對(duì)優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的選擇趨勢(shì)也增加，魚產(chǎn)品作為蛋白質(zhì)和必需微量營(yíng)養(yǎng)素的重要來(lái)源之一，其發(fā)展的健康和穩(wěn)定十分重要[2]，并且魚類產(chǎn)品消費(fèi)的益處遠(yuǎn)大于危害[3]。然而，魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)活動(dòng)易受到多種因素的影響，且魚類生存對(duì)水質(zhì)、水溫等生存環(huán)境存在著嚴(yán)格的要求，近年來(lái)，為了滿足水產(chǎn)品日益增長(zhǎng)的需求，多數(shù)地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式從粗放型轉(zhuǎn)變?yōu)榧s型，因此，極易導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的暴發(fā)[4]，且不同的魚類物種所面臨的病害問(wèn)題也不同，主要是細(xì)菌性和病毒性疾病。如由鰻弧菌Vibrioanguillarum引起的牙鲆Paralichthysolivaceus弧菌病[5]，這對(duì)分布在中國(guó)、日本和韓國(guó)海域的海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失[6-7]。半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis是分布在中國(guó)沿海地區(qū)具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的名貴魚類，其生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美，但近年來(lái)隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，細(xì)菌病害威脅越來(lái)越嚴(yán)重，其中，哈維氏弧菌Vibrioharveyi是侵入半滑舌鰨的主要細(xì)菌性病原之一，能夠引起爛鰭等疾病[8-9]。此外，哈維氏弧菌也可誘發(fā)大黃魚Larimichthyscrocea弧菌病[10]，更為嚴(yán)重的是若誤食感染哈維氏弧菌的食物或水，會(huì)引發(fā)人腹瀉或敗血癥、中耳炎等疾病[11]。羅非魚Oreochromisspp.是聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織推薦的21世紀(jì)重要淡水養(yǎng)殖品種之一，是全球未來(lái)動(dòng)物性蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一[12]，但羅非魚集約化養(yǎng)殖模式的大規(guī)模推廣及養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，使得病害暴發(fā)越來(lái)越嚴(yán)重，特別是無(wú)乳鏈球菌Streptococcusagalactiae感染的傳播速度和引起的死亡率逐漸增加。2009年以來(lái)，在以色列、厄瓜多爾、埃及、泰國(guó)和印度等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的羅非魚中暴發(fā)了一種由羅非魚湖病毒(Tilapia Lake virus, TiLV)引起的病毒性疾病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為一種新生病毒，對(duì)羅非魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重威脅[13-14]。除此之外，鯽皰疹病毒(Carassiusauratusherpesvirus, CaHV)和草魚Ctenopharyngodonidellus呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)等其他多種魚類病害也頻頻暴發(fā)。因此，為保障魚類養(yǎng)殖業(yè)的綠色健康發(fā)展，培育抗病力強(qiáng)的優(yōu)良品種就顯得十分重要。

1 魚類抗病育種的起源

從病理學(xué)研究上來(lái)看，人們已經(jīng)掌握了多種治療或預(yù)防魚類疾病的方法，如使用抗生素、化療藥物及接種疫苗等。但過(guò)度使用抗生素不僅會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，抗生素進(jìn)入到人體中也會(huì)對(duì)人造成傷害[11]；化療藥物的使用易造成環(huán)境污染及副作用發(fā)生；而疫苗接種及益生菌和免疫刺激劑的使用等相關(guān)方法在養(yǎng)殖實(shí)踐中難以大規(guī)模實(shí)施[15]。因此，國(guó)內(nèi)外專家開(kāi)始研究魚類固有的抗病遺傳因素，并進(jìn)行選擇育種從而建立抗病品系[16]。與其他物種相比，魚類的選擇育種研究起源較晚。

國(guó)外第一次有文獻(xiàn)記載的魚類選擇育種是1920年在美洲紅點(diǎn)鮭Salvelinusfontinalis中進(jìn)行的抗病新品系培育[17]。國(guó)內(nèi)科學(xué)系統(tǒng)的魚類選擇育種起源較晚，20世紀(jì)70年代出現(xiàn)相關(guān)研究[18]?？共∮N相關(guān)研究起源于吳維新等[19]將鯉和草魚雜交一代與草魚回交獲得三倍體草魚型雜種，并經(jīng)多年從雜交一代異緣四倍體中選育出可育的二倍體83-2系抗病草魚[20]。

近年來(lái)，隨著魚類遺傳學(xué)的不斷創(chuàng)新發(fā)展，以及對(duì)魚類基因組的探索，研究人員建立了一系列的育種技術(shù)，包括家系與群體選育、分子標(biāo)記輔助選育和全基因組選育等。

2 國(guó)內(nèi)魚類家系及群體選育研究

家系選育是應(yīng)用較為廣泛的育種方式，也為分子育種奠定了基礎(chǔ)。其原理是通過(guò)逐代提高目的基因的純合度，建立優(yōu)良性狀家系，獲得具有優(yōu)良性狀且穩(wěn)定的新品種，實(shí)際上就是對(duì)基因型的選擇。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員采用此方法在多種魚類的抗病育種工作中取得了重要進(jìn)展，如牙鲆、虹鱒Oncorhynchusmykiss和草魚等。通過(guò)加性遺傳方差分析證明，對(duì)虹鱒病毒性出血性敗血病抗病力進(jìn)行選育的方法是可行的[21]。通過(guò)自然選擇和人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiellatarda，對(duì)63個(gè)牙鲆家系的生長(zhǎng)和抗病性能進(jìn)行初步測(cè)定，從中鑒定得到3個(gè)抗病力強(qiáng)的家系[22]；進(jìn)一步以抗病牙鲆品種為親本建立了57個(gè)家系，選擇其中46個(gè)家系進(jìn)行感染試驗(yàn)，從中鑒定出5個(gè)抗病家系[23]；從28個(gè)優(yōu)質(zhì)抗病牙鲆家系中篩選得到7個(gè)高抗病力(攻毒感染存活率>66%)的家系[24]；在建立的抗淋巴囊腫(Lymphocystis disease，LD)牙鲆品系中，通過(guò)在淋巴囊腫病高發(fā)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行天然攻毒試驗(yàn)，得到G2家系，以此為基礎(chǔ)繼續(xù)選育，有望得到抗LD牙鲆新品種[25]。另外，遺傳評(píng)定模型分析表明，采用家系選育的方式適合對(duì)半滑舌鰨抗哈維氏弧菌性狀進(jìn)行選育[26]。在野生草魚中已被證實(shí)抗GCRV能力較好的個(gè)體遺傳力較高，為構(gòu)建草魚選擇育種提供了基礎(chǔ)[27]。

除此之外，采用上述類似的方法在其他魚類選擇育種中也取得了一定進(jìn)展。許氏平鲉Sebastesschlegelii的遺傳改良和優(yōu)質(zhì)新品系選育就是通過(guò)群體選育和家系選育相結(jié)合的方法進(jìn)行的[28]。羅非魚不同家系的抗鏈球菌能力存在顯著性差異[29]；通過(guò)對(duì)42個(gè)吉富羅非魚Oreochromisniloticus家系人工腹腔注射感染無(wú)乳鏈球菌，評(píng)估篩選出抗病力強(qiáng)且生長(zhǎng)速度快的7個(gè)家系[30]；吉富羅非魚經(jīng)過(guò)2個(gè)世代的選育，抗病能力便得到了較大提高[31]。羅非魚不同品種間的抗病力也不同[32-35]，這為新品種的選育提供了基礎(chǔ)和材料。此外，鏡鯉Cyprinuscarpiovar.specularis抗錦鯉皰疹病家系選育已經(jīng)進(jìn)行到了F3代[36]。

以上研究結(jié)果均表明，家系選育是培育魚類抗病優(yōu)良品種的有效途徑，且已在多種魚類選育中取得成功，證明其是培育抗病新品系的重要手段。

3 魚類抗病選育的分子標(biāo)記輔助研究

常規(guī)的魚類育種選育策略是利用細(xì)菌或病毒對(duì)種群內(nèi)的個(gè)體感染以篩選出抗病能力較強(qiáng)的個(gè)體留種選育。但因魚類的抗病力不僅受遺傳影響，而且受環(huán)境影響，表型變異不能完全或真實(shí)地反映遺傳變異[37]，所以這種方法可信度不高，并且選育周期長(zhǎng)。隨著遺傳學(xué)研究的發(fā)展，尤其是“數(shù)量遺傳學(xué)理論”的提出，動(dòng)物育種技術(shù)進(jìn)入到快速發(fā)展時(shí)期。數(shù)量遺傳學(xué)理論的觀點(diǎn)是生物的若干性狀(如抗病)是由許多微小的基因共同決定的，這些微小基因被稱為數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)。但若僅研究控制某一性狀的多個(gè)微小基因，無(wú)法準(zhǔn)確定位到每一個(gè)微小基因并準(zhǔn)確估計(jì)其單個(gè)基因的效應(yīng)[38]。分子標(biāo)記技術(shù)是傳統(tǒng)育種選育技術(shù)的輔助手段，即保留了家系選育的優(yōu)點(diǎn)，也能夠?qū)τ谀承┬誀畹腝TL位點(diǎn)進(jìn)行精確定位，篩選和培育優(yōu)良品種。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記進(jìn)行區(qū)域或全基因組篩選，從而減少連鎖冗余，達(dá)到提高育種效率的目的。目前，在魚類抗病育種中應(yīng)用較多的分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)主要有微衛(wèi)星標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性(SNP)技術(shù)兩種。

3.1 魚類抗病相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選及QTL定位

微衛(wèi)星標(biāo)記是均勻分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間呈高度變異性且數(shù)量豐富，故該技術(shù)應(yīng)用廣泛。采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同家系間的遺傳結(jié)構(gòu)和差異進(jìn)行分析，構(gòu)建高密度遺傳連鎖圖譜并對(duì)抗病基因進(jìn)行精準(zhǔn)的QTL定位，可為后續(xù)的抗病選育奠定基礎(chǔ)。

在中國(guó)，由微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建的魚類高密度遺傳連鎖圖譜首先在鯉Cyprinuscarpio[39]、半滑舌鰨[40]、牙鲆[41]、鰱Hypophthalmichthysmolitrix[42]和鳙Aristichthysnobilis[43]等幾種重要經(jīng)濟(jì)魚類中完成(表1)。目前，將與 LD 抗性相關(guān)的遺傳連鎖圖譜連鎖群LG15上的主要基因座LD-R作為標(biāo)記輔助育種的候選微衛(wèi)星基因座，成功獲得牙鲆Paralichthysolivaceus抗病品系[6, 44]。采用基因分型微衛(wèi)星識(shí)別方法已成功對(duì)大西洋鮭Salmosalar抗傳染性鮭魚貧血癥進(jìn)行QTL定位[45]。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已成功對(duì)4種大菱鲆Scophthalmusmaximus品系的殺鮭氣單胞菌Aeromonassalmonicida抗性進(jìn)行QTL定位[46]。利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)在吉富品系尼羅羅非魚中篩選出2個(gè)與抗病性狀相關(guān)的位點(diǎn)[47]。采用混合分離子分析法(bulked segregant analysis，BSA)對(duì)半滑舌鰨中169個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行篩選，在感染試驗(yàn)存活率為52.22%的家系中得到了1個(gè)可能與抗哈維氏弧菌相關(guān)的微衛(wèi)星標(biāo)記，并成功對(duì)其進(jìn)行了QTL定位，這為選育抗病新品種提供了基礎(chǔ)和依據(jù)[9]。目前，在多種魚類中完成了對(duì)抗病基因的精準(zhǔn)QTL定位(表2)。

表1 部分魚類微衛(wèi)星遺傳連鎖圖譜構(gòu)建情況

表2 部分魚類抗病相關(guān)QTL定位

3.2 基于候選基因的魚類抗病相關(guān)SNP標(biāo)記篩選

SNP是第三代分子標(biāo)記技術(shù)，能夠建立起更加密集的SNP圖譜，遺傳穩(wěn)定性高、位點(diǎn)豐富且分布廣泛、易于基因分型，從而定位出與目的性狀更加緊密相關(guān)的標(biāo)記或QTL區(qū)間[66]。近年來(lái)，SNP標(biāo)記篩選技術(shù)在魚類育種中得到廣泛應(yīng)用(表3)。

表3 部分魚類抗病相關(guān)SNP標(biāo)記的篩選研究進(jìn)展

評(píng)估SNP位點(diǎn)的多態(tài)性并采用Snapshot法進(jìn)行分型驗(yàn)證，在鯉的11個(gè)基因中檢測(cè)到20個(gè)可用于連鎖分析的標(biāo)記[67]。草魚作為中國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖魚類，病害頻發(fā)嚴(yán)重,缺乏良種，但草魚的優(yōu)良性狀選育已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展。目前，利用測(cè)序篩查SNP位點(diǎn)，并采用Snapshot進(jìn)行分型驗(yàn)證的方法，在草魚抗呼腸孤病毒基因Mx2、TLR3(Toll樣受體基因3)、補(bǔ)體C6、RIG-Ⅰ(視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白Ⅰ)、LGP2(RIG-Ⅰ樣受體家族成員遺傳生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室2,laboratory of genetics and physiology 2)、MAD5(黑色素瘤分化相關(guān)基因5， melanoma differentiation-associated gene 5)和IPS-Ⅰ(β-干擾素啟動(dòng)子刺激因子Ⅰ， interferon-b promoter stimulator Ⅰ)中發(fā)現(xiàn)多個(gè)對(duì)草魚GCRV抗性或易感性性狀顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)及單倍型。這些SNP位點(diǎn)和單倍型可以作為潛在的分子標(biāo)記輔助篩選草魚抗出血病品系[68-75]。通過(guò)人工感染篩選出異育銀鯽Carassiusauratusgibelio易感克隆系和抗性克隆系，進(jìn)一步鑒定出8個(gè)干擾素(interferon, IFN)相關(guān)基因與抗CaHV的侵染有關(guān)，可為今后異育銀鯽抗病育種提供科學(xué)依據(jù)[76-77]。利用測(cè)序篩查SNP位點(diǎn)并采用Snapshot進(jìn)行分型驗(yàn)證的方法，在羅非魚IPS-Ⅰ、NOD1(核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域1,nucleotide binding and oligomerization domain 1)、β2m(β2-微球蛋白，β2-microglobulin)、IKaros(C2H2型鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子)、LBP(脂多糖結(jié)合蛋白， lipopolysaccharide binding protein)和MCP-8(肥大細(xì)胞蛋白酶-8, mast cell protease-8)基因中篩選到與無(wú)乳鏈球菌抗性/易感相關(guān)單倍型或SNP位點(diǎn)[78-83]。這些SNP位點(diǎn)和單倍型可以作為潛在的分子標(biāo)記輔助篩選羅非魚抗鏈球菌病品系。

4 候選基因MHC多態(tài)性與抗病性的相關(guān)性

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是編碼動(dòng)物主要組織相容性抗原基因群的統(tǒng)稱，分為MHCⅠ類和Ⅱ類分子，由其所編碼的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)膜蛋白可以結(jié)合內(nèi)外源抗原并呈遞給T淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。多基因性、高度多態(tài)性是與抗病力相關(guān)的MHC類基因的兩個(gè)重要特性，目前公認(rèn)其是研究與抗病/敏感表型相關(guān)聯(lián)的多態(tài)性分子標(biāo)記最合適的候選基因。Miretti等[87]2005年發(fā)表了涵蓋人MHC基因區(qū)域4.46-Mb高分辨率(1.9 kb)的連鎖不平衡圖譜及第一代標(biāo)簽SNP，這使得基因分型效率增加了5倍，從而可用于未來(lái)與MHC相關(guān)的所有疾病研究中。由于魚類MHC的高度多態(tài)性，其在抗病選育中備受關(guān)注，如在大西洋鮭、虹鱒和鏡鯉等魚類中發(fā)現(xiàn)，MHC位點(diǎn)具有高度多態(tài)性且與抗病力有關(guān)[88-89]。

4.1 魚類MHCⅠ 類基因

1990年，研究者第一次擴(kuò)增出魚類的MHCⅠA鏈基因[90]，1993年，在大西洋鮭中測(cè)得第一條魚類MHCⅠA鏈 cDNA全序列[91]，隨后陸續(xù)報(bào)道了多種魚類的MHCⅠ類基因cDNA序列。不同的硬骨魚類中MHC基因的拷貝數(shù)不同，但其結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物相似。

4.2 魚類MHC Ⅱ類基因

1993年，第一條魚類MHCⅡA基因cDNA序列首次在斑馬魚中被報(bào)道[92]。根據(jù)目前所得到的魚類MHCⅡAcDNA分子序列，推測(cè)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物相似。MHCⅡB基因是MHC基因中被研究最多的，其具有豐富的多態(tài)性，如牙鲆MHCⅡB基因的多態(tài)性[93]。

4.3 MHC 基因多態(tài)性與魚體抗病性的關(guān)系

1999年，Van Muiswinkel等[94]提出MHC與魚類疾病抗性具有重要關(guān)系。之后，國(guó)內(nèi)外對(duì)多種魚體抗病性與MHC多態(tài)性的關(guān)系進(jìn)行了研究(表4)。如急性病毒感染過(guò)程中，虹鱒MHCⅠ基因在病毒感染期間表達(dá)顯著下調(diào)[89]。大西洋鮭MHCⅠ和MHCⅡ類基因的多態(tài)性也與抗貧血病毒和癤病有關(guān)[95]。

表4 MHC基因多態(tài)性與魚體疾病抗性的關(guān)系

4.3.1MHCⅡA基因多態(tài)性與抗病性 荷包紅鯉CyprinuscarpioLinnaeusMHCⅡA類基因具有較高的多態(tài)性，等位基因Cyca-DXA4和Cyca-DXA5與對(duì)嗜水鏈球菌的敏感性顯著相關(guān)，而Cyca-DXA17、Cyca-DXA18和Cyca-DXA19與其對(duì)嗜水鏈球菌病抗性相關(guān)[96]。團(tuán)頭魴MHCⅡA基因的多態(tài)性與抗細(xì)菌性敗血癥性狀也具有顯著關(guān)聯(lián)[84]。在牙鲆60個(gè)家系的MHCⅡA和MHCⅡB基因中，篩選到與弧菌病抗性密切相關(guān)的抗病/敏感家系MHC等位基因，其可作為分子標(biāo)記進(jìn)行抗弧菌病牙鲆品系的選育[97-98]。通過(guò)新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)侵染試驗(yàn)研究了MHCⅡA基因多態(tài)性與斜帶石斑魚Epinepheluscoioides抗病/敏感性的關(guān)系，結(jié)果得到了37個(gè)高多態(tài)性等位基因，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)，與SGIV敏感性和SGIV抗性相關(guān)的等位基因各一個(gè)[99]。在黃河鯉中發(fā)現(xiàn)多個(gè)維氏氣單胞菌Aeromonasveronii易感性相關(guān)的等位基因，經(jīng)驗(yàn)證MHCⅡ類基因在黃河鯉抵抗病原入侵的過(guò)程中有著不可或缺的重要作用[100]。大西洋鮭MHCⅡ基因多態(tài)性與對(duì)鮭瘡痂魚虱Lepeophtheirussalmonis的敏感性間具有相關(guān)性[101]。在虹鱒中采用聚合酶鏈反應(yīng)-SSCP分析技術(shù)等方法檢測(cè)MHCⅡA類DAA基因(尤其是外顯子2)的多態(tài)性，并研究其與對(duì)傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)抵抗力的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與抗性有關(guān)的兩個(gè)等位基因Onmy-DAA*1301和Onmy-DAA*0304[102]。從鮸魚Miichthysmiiuy中發(fā)現(xiàn)共有48個(gè)(Mimi-DAB)功能基因，并預(yù)測(cè)有14個(gè)MHCⅡB類位點(diǎn)與抗原結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)；還鑒定出40個(gè)MHCⅡA類(Mimi-DAA)功能基因，預(yù)測(cè)有5個(gè)位點(diǎn)與肽抗原的結(jié)合有關(guān)[103-104]。尼羅羅非魚個(gè)體中MHCⅡA類基因多態(tài)性與無(wú)乳鏈球菌感染的易感程度間的關(guān)聯(lián)分析表明，等位基因orni-daa*1101與無(wú)乳鏈球菌的易感性有關(guān)；而MHCⅡA等位基因第2外顯子可用于探索疾病易感性或抗性與MHCⅡA的多樣性間的聯(lián)系[105]。Wynne等[106]利用MHCⅡ類基因作為分子標(biāo)記成功地篩選出了抗阿米巴鰓病(Amoebic gill disease, AGD)的大西洋鮭品系。

4.3.2MHCⅡB基因多態(tài)性與抗病性 在關(guān)于MHCⅡB基因的研究中，研究人員通過(guò)分析抗病和不抗病牙鲆的MHCⅡB基因多態(tài)性，篩選得到與抗病相關(guān)聯(lián)的MHCⅡB等位基因[93]。采用RACE法成功克隆出赤點(diǎn)石斑魚EpinephelusakaaraMHCⅡB基因的cDNA全序列，并利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析技術(shù)證明了赤點(diǎn)石斑魚MHCⅡB的表達(dá)多態(tài)性[107]。對(duì)斜帶石斑魚MHCⅡB基因多態(tài)性也進(jìn)行了研究，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果證明，等位基因EPCO-DBB*1001與SGIV抗性顯著相關(guān)[108]。在對(duì)半滑舌鰨MHCⅡB基因多態(tài)性與抗病相關(guān)性的研究中，得到9個(gè)與鰻弧菌病抗性/敏感性相關(guān)的位點(diǎn)[109]。在虹鱒中鑒定出45個(gè)不同的MHCⅡB類等位基因，其中Onmy-DAB*0201、Onmy-DAB*0904和Onmy-DAB*1102與IHNV易感性相關(guān)[110]。在大菱鲆抗病性與MHCⅡB基因多態(tài)性的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),與抗病/敏感相關(guān)的MHCⅡB基因型各1個(gè)[111]。在“全紅”體色甌江彩鯉Cyprinuscarpiovar.color中也發(fā)現(xiàn)了與抗病/易感病群體相關(guān)的MHCⅡB基因型[112]。卵形鯧鯵TrachinotusovatusMHCⅡB 基因第2外顯子多態(tài)性與美人魚發(fā)光桿菌Photobacteriumdamsela抗性/敏感性有關(guān)，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，1個(gè)等位基因與其抗性有關(guān)，3個(gè)等位基因與其敏感性有關(guān)[113]。根據(jù)尼羅羅非魚F1代基因型和F3代鏈球菌抗性/易感性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明，MHCⅡB等位基因Orni-DAB*0107、Orni-DAB*0201和Orni-DAB*0302與鏈球菌抗性顯著相關(guān), 等位基因Orni-DAB*0701與鏈球菌易感顯著相關(guān)[114]。在該研究之前，對(duì)尼羅羅非魚的研究也表明，MHCⅡB等位基因Orni-DAB*0201與鏈球菌抗性顯著相關(guān)[115]。因此，MHCⅡB等位基因Orni-DAB*0201可以作為尼羅羅非魚抗鏈球菌病選育的分子標(biāo)記，用于將來(lái)的抗病輔助育種。

5 全基因組抗病選擇育種研究

2001年Meuwissen等[117]提出了全基因組選擇的概念。用覆蓋全基因組的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選育的手段，是對(duì)傳統(tǒng)標(biāo)記輔助選育的創(chuàng)新和改進(jìn)，這已經(jīng)成為動(dòng)物遺傳改良的研究熱點(diǎn)及運(yùn)用到育種生產(chǎn)中的重要手段。其主要方法是通過(guò)全基因組中大量的高密度遺傳標(biāo)記估計(jì)出不同染色體片段或單個(gè)標(biāo)記效應(yīng)值，然后將個(gè)體全基因組范圍內(nèi)片段或標(biāo)記效應(yīng)值累加，從而獲得基因組估計(jì)育種值。目前，利用大黃魚基因組育種值篩選抗性親本取得了較好的效果[118]。所以全基因組測(cè)序及高密度遺傳圖譜的建立和遺傳育種值的預(yù)測(cè)模型在全基因組選擇技術(shù)中十分重要。

5.1 全基因組測(cè)序

國(guó)外對(duì)魚類全基因組測(cè)序的研究起步較早，始于20世紀(jì)90年代中期。2002年研究者完成第一個(gè)全基因組測(cè)序的魚類——紅鰭東方鲀Takifugurubripes[119]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的魚類全基因組被測(cè)序，如青鳉Oryziaslatipes[120]、斑馬魚Daniorerio[121]、虹鱒[122]和大西洋鮭[123]等28種魚類。

國(guó)內(nèi)對(duì)魚類全基因組測(cè)序的研究起步較晚，2014年，中國(guó)完成了半滑舌鰨的全基因組測(cè)序和精細(xì)圖譜的繪制[124]；同年，鯉的全基因組測(cè)序完成[125]。目前，研究人員已完成了包括4種灘涂魚Scartelaoshistophorus、Boleophthalmuspectinirostris、Periophthalmodonschlosseri、Periophthalmusmagnuspinnatus[126]，以及大黃魚[127]、草魚[128]、牙鲆[129]、鞍帶石斑魚Epinepheluslanceolatus[130]等共23種魚類的全基因組測(cè)序[131]。

5.2 基于SNP標(biāo)記的精細(xì)遺傳圖譜構(gòu)建

目前，多種魚類的高密度遺傳連鎖圖譜已構(gòu)建完成，如在牙鲆中構(gòu)建了12 712個(gè)SNP標(biāo)記平均間隔為0.47 cM的高密度遺傳連鎖圖譜，并定位得到9個(gè)與鰻弧菌抗性相關(guān)的QTL位點(diǎn)[85]。除此之外，團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala[132]、中華鱘Acipensersinensis[133]、鳙[134]、鯉[135]等其他魚類的高密度遺傳連鎖圖譜也構(gòu)建完成[131]。

5.3 全基因組抗病育種研究

5.3.1 基于高通量測(cè)序技術(shù)的全基因組SNP位點(diǎn)的分型 隨著高通量SNP標(biāo)記檢測(cè)成本的不斷降低，以及基因分型和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，全基因組選擇技術(shù)開(kāi)始被成功應(yīng)用于育種實(shí)踐當(dāng)中。目前，基于2b-RAD高通量測(cè)序的基因型分型技術(shù)已建立并被廣泛應(yīng)用[136]。采用2b-RAD方法進(jìn)行基于SNPs的基因分型，可以有效地捕獲抗病力的遺傳變異[137-138]。根據(jù)草魚基因組SNP電子芯片對(duì)感染GCRV后的全同胞群體草魚中存活個(gè)體和死亡個(gè)體的基因分型進(jìn)行基因組重測(cè)序，從篩選得到的具有顯著差異的1 822個(gè)基因型位點(diǎn)中獲得9個(gè)抗病相關(guān)基因和10個(gè)顯性等位基因位點(diǎn)，進(jìn)一步采用高通量SNP分型技術(shù)篩選野生群體中攜帶抗病基因的草魚個(gè)體，以此為親本人工繁育出抗病群體[128]。降低基因分型成本的策略：1)選擇極端表型(EP)或預(yù)選擇SNP以構(gòu)建候選基因的低密度標(biāo)記，而且單標(biāo)記分析是預(yù)選擇SNP中節(jié)省候選基因分型成本的最可行方法；2)在基因組選擇中，利用極端表型選擇和單標(biāo)記分析相結(jié)合的方法，顯示出了較好的結(jié)果[139]。Wang等[140]也建立了一種高通量、低成本的基因型分析技術(shù)。

5.3.2 全基因組育種值的預(yù)測(cè)方法 在全基因組抗病育種技術(shù)研究過(guò)程中，研究人員開(kāi)發(fā)了多種全基因組育種值預(yù)測(cè)方法(表5)。對(duì)虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，所有全基因組育種值的預(yù)測(cè)方法精度都高于系譜的BLUP(P-BLUP)方法，其中，貝葉斯C(BayesC)的精度相對(duì)提高最多[141-142]。在大黃魚Larimichthyscrocea育種中，采用基于測(cè)序的基因分型構(gòu)建NGS測(cè)序文庫(kù)，得到約30 000個(gè)SNPs，根據(jù)擬合預(yù)測(cè)精度曲線估計(jì)基因組預(yù)測(cè)中特定性狀的算法達(dá)到理想預(yù)測(cè)精度所需的訓(xùn)練規(guī)模，并成功評(píng)估了預(yù)選擇SNPs的可行性[143]。目前，Dong等[144]開(kāi)發(fā)了兩種新的大黃魚基因組育種值的計(jì)算策略：一種是針對(duì)非基于馬爾科夫鏈-蒙特卡洛算法(MCMC)的快速混合正態(tài)分布(FMixP)策略，另一種是針對(duì)基于MCMC的MixP(MMixP)策略。該研究中使用4種方法BayesA、BayesCπ、MMixP和FMixP來(lái)比較預(yù)測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明，對(duì)于模擬數(shù)據(jù)，BayesCπ、MMixP和FMixP的性能優(yōu)于BayesA，F(xiàn)MixP在計(jì)算上比基于MCMC的方法快得多，但是所有方法對(duì)于大黃魚基因組育種值的預(yù)測(cè)能力都非常相似，該研究結(jié)果可能被應(yīng)用于基因組育種值預(yù)測(cè)中；另外，Dong等[145]還提出了一種計(jì)算速度明顯快于BayesC的快速貝葉斯C(fBayesC)方法，在基因組育種值預(yù)測(cè)上是可行的；該研究者還研究了對(duì)SNP基因型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化與否條件下先驗(yàn)超參數(shù)的兩種策略，并分別計(jì)算了7種預(yù)測(cè)模型(嶺回歸BLUP、BayesA、BayesB、BayesCπ、快速BayesB(fBayesB)、FMixP和MMixP)在兩種策略下的基因組育種值，提出了先進(jìn)行SNP基因型標(biāo)準(zhǔn)化，再設(shè)定先驗(yàn)分布參數(shù)值的建議[146]?！蚌覂?yōu)2號(hào)”牙鲆新品種培育過(guò)程中，采用BayesCπ和GBLUP兩種算法進(jìn)行獨(dú)立個(gè)體育種值估算，從而建立了抗病牙鲆品系的基因組選擇育種技術(shù)，成功培育出“鲆優(yōu)2號(hào)”牙鲆新品種[147]。對(duì)半滑舌鰨良種選育研究表明，通過(guò)BayesCπ模型進(jìn)行全基因組選擇育種會(huì)取得較好效果，為通過(guò)芯片分型對(duì)半滑舌鰨全基因組選擇育種奠定了基礎(chǔ)[148]。

表5 全基因組選擇計(jì)算方法

5.3.3 基于全基因組關(guān)聯(lián)分析篩選抗病相關(guān)SNP位點(diǎn) 全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)是篩選抗病相關(guān)SNP位點(diǎn)的重要手段。在鱸抗病研究中，采用一種簡(jiǎn)化的高通量測(cè)序技術(shù)——限制性位點(diǎn)相關(guān)DNA測(cè)序方法得到了病毒性神經(jīng)壞死鱸的全基因組SNP數(shù)據(jù)，并對(duì)其進(jìn)行GWAS，檢測(cè)了個(gè)體SNP與VNN抗性間的關(guān)聯(lián)[150]。對(duì)大西洋鮭的育種研究表明，基因組預(yù)測(cè)精度比傳統(tǒng)預(yù)測(cè)模型獲得的基因組預(yù)測(cè)精度高18%[151]。對(duì)大西洋鮭進(jìn)行GWAS，獲得5個(gè)與抗AGD顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)[152]。在半滑舌鰨抗病性研究中，通過(guò)GWAS、Fst和核苷酸多樣性篩選結(jié)合的方法識(shí)別對(duì)抗病性重要的位點(diǎn)，在基因組重測(cè)序中鑒定的 1 016 774 個(gè)SNPs位點(diǎn)中檢測(cè)到 33 個(gè)與抗病性顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)[153]。

5.3.4 基于GWAS的QTL定位 采用GWAS法進(jìn)行QTL定位，可以為魚類抗病提供有價(jià)值的候選基因。如采用GWAS法發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與斑點(diǎn)叉尾鮰Ictaluruspunctatus的柱狀病抗性相關(guān)的QTL[149]，并發(fā)現(xiàn)了9個(gè)與斑點(diǎn)叉尾鮰愛(ài)德華氏菌Edwardsiellaictalurid免疫性相關(guān)的QTL[154]。在虹鱒中進(jìn)行GWAS,檢測(cè)到10個(gè)與抗病相關(guān)的QTL[155]。在感染錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)鏡鯉的重要QTL或SNP周圍發(fā)現(xiàn)了許多與免疫相關(guān)的基因，包括tnfa、hif1a、galectin-8、rootletin和palladin，并利用公開(kāi)的KHV感染鯉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得了候選基因的表達(dá)模式，這為鯉對(duì)KHV抗性的遺傳結(jié)構(gòu)研究提供了許多候選基因[114]。在鯉的LG 44上鑒定出一個(gè)與KHV抗性相關(guān)的QTL[156]。對(duì)虹鱒30 060個(gè)SNP進(jìn)行GWAS，檢測(cè)到幾個(gè)QTL可能與抗冷水細(xì)菌病有關(guān)[157]。對(duì)大西洋鮭進(jìn)行GWAS，在第二染色體的QTL區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個(gè)可能與抗AGD有關(guān)的候選基因[152]。在大西洋鮭Ssa27和Ssa12染色體上發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與心肌炎病毒(piscine myocarditis virus，PMCV)有關(guān)的QTL，其中包括多個(gè)免疫相關(guān)基因，如MHCⅡ類基因等[158]。

6 存在問(wèn)題及展望

在世界范圍內(nèi)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展速度快于所有其他食用動(dòng)物生產(chǎn)部門，但卻面臨著巨大的疾病感染風(fēng)險(xiǎn)[4]。魚類病害種類多樣、病因復(fù)雜且傳播性強(qiáng)，解決病害問(wèn)題并減少病害帶來(lái)的損失對(duì)整個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)具有重要意義。近年來(lái)，隨著育種技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展，育種水平不斷提高，傳統(tǒng)選育與分子標(biāo)記輔助選育技術(shù)的結(jié)合，以及全基因組選擇模型的不斷優(yōu)化，動(dòng)植物育種工作都取得了很大的進(jìn)展，同時(shí)在魚類育種研究中也取得了一定進(jìn)步。

6.1 抗病育種面臨的問(wèn)題

1)魚類基因組資源開(kāi)發(fā)發(fā)展迅速，但是后基因組時(shí)代，魚類基因功能研究包括抗病相關(guān)基因功能研究相對(duì)滯后。影響魚類基因功能研究的主要因素是相對(duì)于哺乳類，魚類工具細(xì)胞系的建立相對(duì)滯后，目前建立的細(xì)胞系普遍存在轉(zhuǎn)染效率低下的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了魚類基因功能的研究、驗(yàn)證。另外，尚未建立以CRISPR/Cas9等為代表的基因組編輯技術(shù)和平臺(tái)，嚴(yán)重影響了重要抗病性狀關(guān)鍵基因的發(fā)掘及其在抗病育種中的應(yīng)用。

2)魚類抗病育種相關(guān)的基礎(chǔ)研究及抗病分子育種的研究相對(duì)滯后。目前，對(duì)魚類免疫系統(tǒng)的免疫機(jī)制研究還處于初級(jí)階段。對(duì)魚類免疫系統(tǒng)及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，是推動(dòng)魚類抗病育種的基礎(chǔ)，而抗病分子育種的研究是抗病育種的重要手段。

3)魚類抗病育種的基因組選擇研究尚處于初級(jí)階段。價(jià)格低廉的分子標(biāo)記篩選高通量分型平臺(tái)尚未建立，魚類抗病性狀的界定手段還無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，全基因組育種值的統(tǒng)計(jì)方法還處于摸索階段。

6.2 未來(lái)重點(diǎn)研究方向

1)魚類免疫系統(tǒng)的解析。由于魚類免疫知識(shí)的缺乏，限制了免疫系統(tǒng)進(jìn)化研究、疫苗研發(fā)及抗病品種(系)的選育，因此，將來(lái)需要加強(qiáng)魚類免疫系統(tǒng)的解析研究，包括魚類先天免疫和獲得性免疫系統(tǒng)的研究，同時(shí)也包括了免疫負(fù)調(diào)控因子的挖掘及其在先天免疫中作用機(jī)制的解析。

2)魚類全基因結(jié)構(gòu)解析及基因資源的深度挖掘。包括全基因組測(cè)序和精細(xì)圖譜構(gòu)建，魚類基因組的拼接、組裝和生物信息學(xué)分析技術(shù)，闡釋不同魚類基因組的結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化規(guī)律和功能，進(jìn)行基因資源的深度挖掘，包括參考基因組序列及其注釋(編碼和非編碼調(diào)節(jié)元件)、全基因組多態(tài)性標(biāo)記、高效基因分型平臺(tái)、高密度和高分辨率連鎖圖及轉(zhuǎn)錄組資源(包括非編碼轉(zhuǎn)錄本)。

3)加強(qiáng)魚類抗病性狀的遺傳解析及分子育種的基礎(chǔ)研究。借助基因組編輯平臺(tái)和魚類工具細(xì)胞系培養(yǎng)技術(shù)，篩選抗病性狀關(guān)鍵基因，研究和驗(yàn)證基因的具體功能和調(diào)控機(jī)制，闡明基因?qū)共⌒誀畹臎Q定機(jī)制，解析抗病性狀基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為分子設(shè)計(jì)育種奠定理論基礎(chǔ)；深入開(kāi)展抗病性狀的GWAS和基因組選擇及分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)研究，包括全基因組育種值的統(tǒng)計(jì)方法研究、分子標(biāo)記篩選的高通量分型平臺(tái)技術(shù)的建立(如抗病育種芯片)、魚類抗病性狀界定方法標(biāo)準(zhǔn)的建立；拓展抗病性狀相關(guān)分子標(biāo)記和關(guān)鍵基因的篩選與鑒定研究，建立基因與抗病性狀的關(guān)聯(lián)性；定位抗病性狀基因的QTL，明確基因型與抗病表型的關(guān)系。

4)確定抗病性狀遺傳和表觀遺傳調(diào)控。通過(guò)基因組甲基化分析、組蛋白修飾及小核糖核酸(RNA)分析等技術(shù)手段，解析環(huán)境因素介導(dǎo)的抗病性狀形成的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制；建立甲基化修飾因子在水產(chǎn)動(dòng)物中的檢測(cè)技術(shù)體系，篩選與抗病性狀相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記。