牡蠣酶解產(chǎn)物改善睡眠作用效果研究

張婷，秦小明,2*，章超樺,2，曹文紅,2，鄭惠娜,2，高加龍,2，林海生,2

(1.廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東 湛江 524088)

睡眠是人體的主動生理過程，可以恢復(fù)精神和解除疲勞。失眠是指難以入睡、夜間易醒及睡眠質(zhì)量差等睡眠障礙問題[1],失眠對日間工作與生活影響較大，失眠會帶來身體免疫力下降、神經(jīng)功能紊亂、記憶力減退等不良影響[2]。目前，治療失眠多以服用處方藥物為主，然而服用藥物常伴隨過量、依賴性及耐藥性等弊端[3]，因此，急需開發(fā)天然功能活性物質(zhì)用于改善睡眠。

牡蠣廣泛分布于中國廣東、廣西等海域，屬于中國主要經(jīng)濟貝類和四大養(yǎng)殖貝類之一，同時也是第一批納入藥食同源的食物，富含維生素、蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)[4]。酶水解是從蛋白質(zhì)來源獲得生物活性肽的有效方法[5]，研究表明，牡蠣的酶解產(chǎn)物具有免疫[6-7]、抗氧化[8]、創(chuàng)傷愈合[9-10]、抗疲勞[11]、改善學(xué)習(xí)記憶[12]、抗血栓[13]和抑菌[14]等功能活性，然而關(guān)于牡蠣改善睡眠的研究鮮有報道。牡蠣含有豐富的谷氨酸[15]，有助于促進γ-氨基丁酸的合成，同時，其具有較好的抗氧化能力，可以清除多余的氧自由基，對腦神經(jīng)具有保護作用[16]。牡蠣還含有豐富的牛磺酸，這是一種γ-氨基丁酸受體激動劑，有助于促進睡眠[17]。此外，牡蠣中有含量豐富的金屬元素鋅，其可以作為膳食補充劑從而改善睡眠[18]，這為開展改善睡眠研究提供了營養(yǎng)及理論基礎(chǔ)。本試驗中,采用動物蛋白酶對香港牡蠣Crassostreahongkongensis進行酶解，探究了牡蠣酶解產(chǎn)物(enzymatic products of oysters， EPO)對小鼠睡眠的影響，并初步探討了牡蠣酶解產(chǎn)物對睡眠的調(diào)節(jié)機制，以期為后續(xù)研究與產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用新鮮香港牡蠣購自廣東省湛江市東風(fēng)市場。

試驗動物： SPF 級雄性KM小鼠200只，體質(zhì)量為18～22 g(濟南鵬悅試驗動物繁育有限公司)，試驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(魯)2019-0003，試驗動物使用許可證編號為SYXK(粵)2019-0204。

試劑： 動物蛋白酶(廣西南寧龐博生物工程有限公司)、戊巴比妥鈉(Sigma公司)、地西泮(山東信誼制藥有限公司)、巴比妥鈉(國藥集團)、小鼠γ-氨基丁酸(GABA)ELISA 試劑盒、小鼠 5-羥色胺(5-HT)ELISA 試劑盒、小鼠褪黑素(MT)ELISA 試劑盒、小鼠多巴胺(DA)ELISA 試劑盒、小鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA 試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司)。

儀器和設(shè)備： Lynx 6000 型高速冷凍離心機、Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司)、VAPODEST450全自動凱氏定氮儀(德國Gerhardt公司)、ATY124電子天平(日本島津株式會社)、PHS-3E型pH酸度計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、 N-4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(埃朗科技國際貿(mào)易(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 牡蠣酶解產(chǎn)物EPO的制備 參照李婉等[19]的方法略做改進。將牡蠣肉與其3倍體積的蒸餾水進行勻漿，調(diào)節(jié)pH至7.0，加酶量為1 000 U/g，于53 ℃恒溫磁力攪拌水浴鍋中酶解5 h，100 ℃沸水浴滅酶10 min，酶解液冷卻至室溫后，4 ℃下以 8 000 r/min 離心20 min，用紗布過濾去除雜質(zhì)，取上清液進行濃縮，冷凍干燥。

1.2.2 EPO基本營養(yǎng)成分組成測定 參照GB 5009.3—2016、GB 5009.5—2016、 GB 5009.4—2016、GB 5009.6—2016、GB/T 9695.31—2008分別測定水分、粗蛋白質(zhì)、灰分、粗脂肪和總糖含量。

1.2.3 EPO氨基酸組成測定 參照GB 5009.124—2016測定氨基酸組成。

1.2.4 動物分組及處理 試驗小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分組，每組40只，設(shè)陰性對照組 (灌胃等體積蒸餾水)、 陽性對照組 (灌胃地西泮2 mg/kg體質(zhì)量)及EPO低、中、高劑量組(分別灌胃250、500、1 000 mg/kg體質(zhì)量，分別記為EPO-L、EPO-M、EPO-H)。各試驗組每天灌胃一次，灌胃量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.5 直接睡眠試驗 陰性對照組、EPO各劑量組末次灌胃(第30天)后，觀察30 min內(nèi)各組10只小鼠是否進入睡眠狀態(tài)。小鼠翻正反射消失(翻正反射消失是指小鼠處于仰臥位超過10 s不能恢復(fù)背臥位)超過1 min判定小鼠進入睡眠，小鼠恢復(fù)翻正反射判定為小鼠覺醒。統(tǒng)計陰性對照組、EPO各劑量組小鼠入睡數(shù)量[20]。

1.2.6 延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗 各組小鼠末次灌胃1 h后，各取10只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg 體質(zhì)量)，注射量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量。翻正反射消失到恢復(fù)的時間定義為小鼠睡眠時間，比較陰性對照組、陽性對照組、EPO各劑量組小鼠睡眠的時間[20]。

1.2.7 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗 各組小鼠末次灌胃1 h后，各取10只小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質(zhì)量)，注射量為0.1 mL/10 g體質(zhì)量。觀察30 min，統(tǒng)計各組小鼠入睡數(shù)量并計算睡眠發(fā)生率[20]，即

睡眠發(fā)生率=入睡動物數(shù)/每組動物數(shù)×100%。

1.2.8 巴比妥鈉潛伏期試驗 各組小鼠末次灌胃1 h后，各取10只小鼠腹腔注射巴比妥鈉(300 mg/kg 體質(zhì)量)，注射量為 0.1 mL/10 g體質(zhì)量。注射巴比妥鈉到翻正反射消失的時間定義為睡眠潛伏期,比較陰性對照組、陽性對照組、EPO各劑量組小鼠睡眠潛伏期[20]。

1.2.9 神經(jīng)遞質(zhì)水平測定

1)腦組織勻漿液制備。各組小鼠末次灌胃1 h后，各取5只小鼠解剖，于冰上快速取其下丘腦、大腦皮層，稱重后分別與勻漿液PBS按照體積比為1∶9進行勻漿，4 ℃下以3 000 r/min 離心20 min，取上清液，測定5-羥色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、褪黑素(MT)，以及多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE)的含量。

2)指標(biāo)的測定。根據(jù)小鼠5-HT試劑盒說明繪制5-HT含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為

y=0.006 3x+0.088 1(R2=0.992 6)。

根據(jù)小鼠GABA試劑盒說明繪制GABA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為

y=0.249 3x+0.106 7(R2=0.985 2)。

根據(jù)小鼠MT試劑盒說明繪制MT含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為

y=0.02x+0.041 8(R2=0.999 2)。

根據(jù)小鼠DA試劑盒說明繪制DA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為

y=0.011 9x+0.036 4(R2=0.995 6)。

根據(jù)小鼠NE試劑盒說明繪制NE含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為

y=0.175 6x+0.039 5(R2=0.998 7)。

根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算所測樣品的5-HT、GABA、MT、DA和NE含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進行分析，兩組數(shù)據(jù)采用獨立T檢驗法進行分析，多組數(shù)據(jù)采用單因素法(ANOVA)進行方差分析，睡眠發(fā)生率采用卡方檢驗法分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPO的基本營養(yǎng)成分

經(jīng)測定，EPO基本營養(yǎng)成分中粗蛋白質(zhì)含量最高，為(55.81±0.53)%，其次為總糖含量，為(30.83±0.35)%，粗脂肪含量為(8.72±0.20)%，灰分含量為(4.65±0.43)%，水分含量為(4.17±0.12)%。

2.2 EPO的氨基酸組成

從表1可見：EPO氨基酸組成種類齊全，必需氨基酸與氨基酸總和的比值為40.44%，符合FAO/WHO推薦標(biāo)準(zhǔn)中理想蛋白質(zhì)模式，其中蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸的占比分別為8.06%、6.39%、3.24%、6.44%、9.97%、5.67%、0.67%；EPO疏水性氨基酸與氨基酸總和的比值為60.37%，其中脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的占比分別為12.45%、7.20%、9.01%、6.39%、3.24%、6.44%、9.97%、5.67%。

表1 EPO氨基酸組成

2.3 EPO對小鼠直接睡眠的影響

從表2可見，末次灌胃30 min后，陰性對照組和EPO各劑量組小鼠均無直接睡眠現(xiàn)象，即EPO無直接睡眠作用。

表2 EPO對小鼠直接睡眠的影響

2.4 EPO對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時間的影響

從表3可見：陽性對照組、EPO各劑量組較陰性對照組均顯著延長了戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠的睡眠時間(P<0.05)；與陰性對照組相比，陽性對照組對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的小鼠睡眠時間延長了89.82%，低、中、高劑量的EPO對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間分別延長了44.78%、74.52%、45.96%，其中EPO中劑量組相較于其他劑量組，可以較好地延長小鼠睡眠時間。這說明，在一定劑量范圍內(nèi)，EPO與戊巴比妥鈉具有協(xié)同作用，可以延長小鼠睡眠時間。

表3 EPO對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響

2.5 EPO對戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠發(fā)生率的

影響

從表4可見，與陰性對照組相比，陽性對照組、EPO各劑量組的睡眠發(fā)生率均有升高，分別為80%、40%、70%、50%，其中僅陽性對照組、EPO中劑量組與陰性對照組有顯著性差異(P<0.05)。

表4 EPO對戊巴比妥鈉閾下劑量睡眠發(fā)生率的影響

2.6 EPO對巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠潛伏期的影響

從表5可見，與陰性對照組相比，陽性對照組、EPO各劑量組均顯著縮短了小鼠睡眠潛伏期(P<0.05)，其中，EPO中劑量組可將睡眠潛伏期縮至最短。這說明，EPO與巴比妥鈉通過協(xié)同作用，可以顯著縮短小鼠睡眠潛伏期。

表5 EPO對巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

2.7 小鼠下丘腦、大腦皮層的神經(jīng)遞質(zhì)水平含量

小鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)水平含量如表6所示，其中5-HT、GABA與MT為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，與陰性對照組相比，陽性對照組及EPO低、中劑量組下丘腦的5-HT和GABA含量均顯著升高(P<0.05)，EPO高劑量組5-HT和GABA含量略有升高，但無顯著性差異(P>0.05)，陽性對照組、EPO低、中劑量組MT含量有升高(P>0.05)；DA與NE為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，與陰性對照組相比，陽性對照組、EPO各劑量組DA含量均有顯著降低(P<0.05)，EPO低、中劑量組NE含量顯著降低(P<0.05)，陽性對照組、EPO高劑量組NE含量也有所降低，但無顯著性差異(P>0.05)。

表6 EPO對小鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響( n=5)

小鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平含量由表7所示，與陰性對照組相比，陽性對照組大腦皮層5-HT含量顯著升高(P<0.05)，EPO低、中劑量組5-HT含量略有升高，但無顯著性差異(P>0.05)；陽性對照組及EPO低、中劑量組GABA含量均顯著升高(P<0.05)，EPO高劑量組GABA含量略有升高(P>0.05)；陽性對照組、EPO各劑量組MT含量均高于陰性對照組，其中陽性對照組及EPO中、高劑量組MT含量有顯著性提高(P<0.05)；陽性對照組及EPO中、高劑量組DA含量均顯著降低(P<0.05)，EPO低劑量組DA含量略有降低(P>0.05)；EPO高劑量組NE含量顯著降低(P<0.05)，陽性對照組及EPO低、中劑量組NE含量略有降低(P>0.05)。

表7 EPO對小鼠大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響( n=5)

3 討論

3.1 EPO營養(yǎng)成分對改善睡眠作用影響

本研究結(jié)果顯示，EPO蛋白質(zhì)含量豐富，脂肪含量低，其中谷氨酸含量為1.17 g/100 g，占氨基酸總和的5.58%，甘氨酸含量為1.51 g/100 g，占氨基酸總和的7.20%。同時，基于課題組前期研究，相同制備方法下得到的牡蠣酶解產(chǎn)物微量元素中鋅含量最高，為440.67 mg/kg，?；撬岷繛?4.21 mg/g[16]。研究表明，甘氨酸可以通過血腦屏障進入大腦，通過作用于視交叉上核(SCN)中的NMDA受體，從而調(diào)節(jié)睡眠[21]；谷氨酸與牛磺酸可以促進抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的產(chǎn)生，鋅作為膳食補充劑可以起到改善睡眠質(zhì)量的作用[18]。因此，EPO營養(yǎng)成分中相關(guān)氨基酸與微量元素能為改善睡眠提供營養(yǎng)支持。

3.2 EPO對小鼠行為學(xué)的影響

本研究中參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》[20]進行了EPO對小鼠睡眠影響試驗研究。直接睡眠試驗是為了探究EPO是否有直接睡眠效果；戊巴比妥鈉是一種作用于大腦中樞神經(jīng)的藥物，通過肝酶代謝，腹腔注射戊巴比妥鈉后，若試驗組睡眠時間延長并與陰性對照有顯著性差異，即試驗結(jié)果為陽性，說明EPO與戊巴比妥鈉協(xié)同改善睡眠；為排除EPO對肝酶有抑制效果，造成假陽性的結(jié)果，進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗，若試驗組睡眠發(fā)生率與陰性對照有顯著性差異，即試驗結(jié)果為陽性；巴比妥鈉也是對中樞系統(tǒng)有抑制作用的藥物，腹腔注射巴比妥鈉后，若試驗組睡眠潛伏期有顯著縮短，說明EPO與巴比妥鈉也有協(xié)同作用，試驗結(jié)果為陽性。本研究中，延長戊巴比妥鈉睡眠時間試驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠試驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期試驗顯示，2項試驗結(jié)果均為陽性，說明EPO具有改善睡眠的作用。該結(jié)果與Saito等[22]的研究結(jié)果一致。

3.3 EPO對小鼠下丘腦、大腦皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

睡眠是一種晝夜活動，發(fā)生于大腦中，下丘腦、大腦皮層和海馬等神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)與睡眠有著密切的聯(lián)系[23]。下丘腦位于丘腦下方，是高級神經(jīng)中樞，下丘腦中包含大量神經(jīng)元，主要為GABA能神經(jīng)元、下丘腦腹外側(cè)視前核(VLPO)神經(jīng)元和黑色素濃縮激素(MCH)神經(jīng)元，這些神經(jīng)元在促進睡眠中發(fā)揮著重要的作用[24]。大腦皮層中存在著大量的神經(jīng)元細(xì)胞參與睡眠/覺醒調(diào)節(jié)，此外，大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的波動可以產(chǎn)生慢波睡眠，有助于提高睡眠質(zhì)量[25]。神經(jīng)遞質(zhì)分為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[26]。5-羥色胺(5-HT)，又名血清素，是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，研究表明，5-HT含量下降會導(dǎo)致不同程度的失眠[27]。γ-氨基丁酸(GABA)是神經(jīng)中樞的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，由谷氨酸經(jīng)過脫羧合成而來，GABA含量升高有利于睡眠時間的延長，催眠藥物都是基于GABAA受體進行調(diào)控睡眠[28]。褪黑素(MT)是一種由色氨酸合成的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，褪黑素可以縮短入睡潛伏期、延長睡眠持續(xù)時間及提高睡眠質(zhì)量[29]。多巴胺(MT)是去甲腎上腺素的前體，是與睡眠有關(guān)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，多巴胺可以調(diào)節(jié)情緒，并促進覺醒[30]。去甲腎上腺素(NE)也是促進覺醒的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，失眠狀態(tài)下，NE含量升高[31]。本研究中，與陰性對照組相比，EPO各劑量組中5-HT、GABA和MT含量的升高，可能與牡蠣中含有的谷氨酸、?；撬嵊嘘P(guān)[16-17]，而EPO各劑量組中DA和NE含量的降低，可能與牡蠣中鋅含量豐富有關(guān)[18]。

4 結(jié)論

1)EPO可以提供改善睡眠相關(guān)的甘氨酸、谷氨酸等氨基酸及微量元素，并與戊巴比妥鈉協(xié)同延長小鼠睡眠時間，提高睡眠發(fā)生率，與巴比妥鈉協(xié)同縮短小鼠睡眠潛伏期，具有改善睡眠的作用。

2)EPO通過提高腦內(nèi)5-HT、GABA、MT抑制性神經(jīng)遞質(zhì)含量，降低DA、NE興奮性神經(jīng)遞質(zhì)含量，起到改善睡眠的作用。

3)EPO 3個劑量均有改善睡眠的作用，其中用EPO 500 mg/kg體質(zhì)量灌胃小鼠，改善睡眠效果最佳。