Zn2+脅迫對花斑裸鯉抗氧化關鍵基因表達和抗氧化酶活性的影響

冉鳳霞，金文杰，端智卓瑪，黃屾，劉艷慧，李梓瑄，王振吉，吳明輝，簡生龍，王國杰，李長忠*

(1.青海大學 生態(tài)環(huán)境工程學院，青海 西寧 810016； 2.青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站，青海 西寧 810012)

重金屬因其潛在毒性、難降解及富集等危害，已成為重要的環(huán)境污染源。研究表明，通過重金屬的瞬時超標或者長期微量積累常常對魚類產生脅迫，影響早期生長發(fā)育，如增加胚胎發(fā)育時間、降低胚胎孵化率、增加畸形率等[1-4]，并引起魚體組織細胞(如肝細胞、鰓和性腺等)超微結構的損傷[5-7]。重金屬污染物對魚類脅迫造成的危害因重金屬離子種類、脅迫濃度、脅迫時間和魚種等因素變化而不同。水體中重金屬離子濃度超過一定閾值時，其毒理效應會表現出來，并造成水生動物受傷、死亡[8]。鋅是生命活動所必需的微量元素之一，具有催化和調節(jié)功能，在營養(yǎng)物質代謝過程中發(fā)揮重要作用，也是糾正免疫應答功能的關鍵元素[9]。當Zn2+缺乏時，會導致中性粒細胞和單核細胞的趨化性降低，細胞免疫反應受損[10]。但是，當Zn2+濃度超過一定濃度時，也會抑制水生生物的生理功能。Zn2+對魚類的毒害作用與其和魚類體內生物大分子上的活性位點結合有關，表現為魚卵的孵化、發(fā)育和繁殖過程受阻，甚至死亡[9]。在Zn2+脅迫下，魚體會產生一種非特異性免疫機制以應對Zn2+引起的免疫和氧化損傷。

多種環(huán)境污染物可誘導水生生物產生氧化應激進而產生活性氧(ROS)，同時產生脂質過氧化、細胞損傷等一系列生理生化反應，因此，氧化應激和抗氧化酶活性水平常作為評價環(huán)境風險的重要指標[11]。核因子NF-E2相關因子(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)屬于CNC亮氨酸拉鏈家族(Cap‘n’Collar basic leucine zipper, CNC-b ZIP)成員，是細胞內緩解氧化損傷和抵抗外來毒性化合物的重要核轉錄因子，通過調節(jié)相關靶基因的表達參與機體內抗氧化和抗炎應激反應、重金屬解毒等生理過程[12-13]。Nrf2可通過調控一系列抗氧化蛋白因子的組成型和誘導型表達，減輕活性氧和親電體引起的細胞損傷，使細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，維持機體氧化還原動態(tài)平衡[11,14]。但金屬暴露會影響Nrf2介導的細胞信號通路，包括Keap1中巰基的還原、MAPK活性的激活、Nrf2的磷酸化等[15]。機體在受到脅迫應激時，Nrf2基因被激活并轉運入核，調控包括超氧化物氣化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等下游抗氧化靶基因的轉錄，保護機體免受氧化損傷[12]。Nrf2 mRNA表達的上調主要是由核易位造成的，核易位由氧化信號誘導，重金屬脅迫促使氧化信號增多，導致核易位細胞數量增多[16-17]。研究發(fā)現，重金屬脅迫會誘導相關抗氧化基因CAT、GPx、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD等表達水平顯著增加[13-14]，以及抗氧化酶SOD和CAT等酶活性顯著升高，而這些基因表達水平的上調與Nrf2/Keap1信號通路有關，因為Nrf2與Keap1的解離是Nrf2核易位的主要機制[14]。因此，研究魚類對重金屬脅迫的分子應答機制，有助于篩選出評估水體污染狀況[18]的分子標記物，掌握魚類生存狀況，提供水體污染預警，為魚類保護和資源恢復提供對策。

花斑裸鯉Gymnocypriseckloni俗稱大嘴魚，隸屬于裂腹魚亞科Schizothoracinae裸鯉屬Gymnocypris[19]，分布于黃河上游段、扎陵湖、鄂陵湖等淡水水域，是黃河上游水域中生物多樣性的重要組成部分，具有重要的生態(tài)保護價值和開發(fā)利用價值。近年來，由于大型水利工程的建設、人為的偷捕亂撈和水環(huán)境的局部污染，花斑裸鯉資源量大幅度減少[20]。目前，國家通過實施花斑裸鯉等土著魚類“三場”(即產卵場、索餌場、越冬場)的生態(tài)修復工程，建立了花斑裸鯉人工增殖放流站，嚴格執(zhí)行漁政執(zhí)法，使得人為因素對土著魚類造成的危害得到有效緩解，而水域環(huán)境污染物尤其是重金屬污染對土著魚類的影響日益受到關注。近年來，雖然黃河上游青海段水質符合國家漁業(yè)二類水質標準，但局部水域因采礦、雨水沖蝕、生活污水和地表徑流等污染會引起瞬時的重金屬離子濃度超標或某些重金屬離子的長期微量污染風險依然存在，尤其是繁殖季節(jié)產卵場的重金屬污染直接威脅著花斑裸鯉等土著魚類的生存。野生花斑裸鯉的孵化、發(fā)育和繁殖是其資源保護和恢復的關鍵，因此，本研究中選擇對野生花斑裸鯉繁育活動影響最直接的Zn2+作為重金屬脅迫源，通過分析Zn2+脅迫下花斑裸鯉特定組織抗氧化關鍵基因和關鍵酶的應答模式，篩選產生脅迫應答的生物標記物，從而更加直接地反映所在水體的Zn2+污染狀況，以期為花斑裸鯉的資源保護與恢復，以及作為水質監(jiān)測預警指標提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用花斑裸鯉由青海省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測站提供，取體格健康的花斑裸鯉，體長為(15±3)cm，體質量為(10±3)g，于青海大學生態(tài)環(huán)境學院水生實驗室水族箱內暫養(yǎng)適應兩周，期間每天10:00投喂一次。試驗用水為曝氣一周的自來水，溶解氧為6.8～7.8 mg/L，pH為6.8～7.5，溫度為(18±2)℃。試驗前用高錳酸鉀(1～200 mg/L)對試驗水族箱進行消毒處理。

1.2 方法

1.2.1 急生毒性試驗 ZnSO4·7H2O購自Sigma-Aldrich公司(St Louis, MO, USA)。采用靜態(tài)水質接觸法[6]進行金屬脅迫試驗。Zn2+脅迫濃度以中國漁業(yè)水質標準(Zn2+質量濃度為0.1 mg/L)為基準，分別將質量濃度擴大10、20、50、100、200倍，即1、2、5、10、20 mg/L，每個質量濃度設置一個平行組，每組投放15尾健康的花斑裸鯉。試驗期間觀察并記錄Zn2+脅迫24、48、72、96 h時魚的死亡數，并觀察魚體的活動狀況，以魚靜臥魚缸底部，不見鰓蓋有呼吸運動，多次觸碰無反應來判斷魚死亡現象。及時撈出死亡個體，記錄死亡數量。采用改進寇氏法公式[21]計算出各脅迫時間下的半致死濃度(LD50,mg/L)，安全濃度為96 h LD50×0.1。

1.2.2 LD50濃度的計算 根據所記錄的魚死亡數，計算出死亡率(P)。改進寇氏法計算公式為

LD50=lg-1[xmax-i(∑P-0.5)]。

其中：xmax為lg(最大劑量)；i為lgd2-lgd1，d2、d1為相鄰兩組劑量；P為各脅迫組花斑裸鯉的死亡率(用小數表示)；∑P為各組P的總和。

lg LD50的標準誤(s50)計算公式為

s50=i×[(∑P- ∑P2)/(n-1)]1/2，

LD50的95%可信限=lg-1(x50±1.96s50),

LD50的平均可信限=LD50±(LD50高限-LD50低限)/2。

其中：n為每組中魚的數量；x50=lg LD50。

1.2.3 樣品的采集 根據本試驗中獲得的Zn2+脅迫不同時間段的半致死濃度，并以中國地表水質量標準第Ⅲ類(GB/T 14848—93)為標準，將Zn2+質量濃度為1.0 mg/L作為本試驗脅迫濃度。在1.0 mg/L Zn2+脅迫12、24、48、72、96 h時，采集不同脅迫時間下的鰓、腎臟和肝臟組織，用液氮速凍后保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)試驗。

1.2.4 總RNA提取 用RNA提取試劑盒(TaKaRa, Japan)提取總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測RNA的完整性和質量。

1.2.5 熒光定量PCR 設計實時熒光定量PCR引物(表1)，以β-actin為內參基因，用熒光定量PCR儀(Light Cycler 96 SW1.1，羅氏)測定Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx的mRNA表達量變化。PCR擴增總體系(共25 μL)：iQTMSYBR Green Supermix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件為：94 ℃下預變性3 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，60 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸40 s，共進行40個循環(huán)。每個樣本設置3個平行。運用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 qPCR檢測的基因及引物序列

1.2.6 基因的應答層次分析 試驗材料與方法同“1.2.3”節(jié)和“1.2.5”節(jié)。基因的應答層次以熱圖方式呈現。將各基因在鰓、腎臟和肝臟組織中的mRNA表達量進行l(wèi)og2均一化處理，然后將所得試驗數據應用HemI 1.0.3.7軟件進行分析作圖?；虮磉_的強弱采用不同顏色表示，可直觀地分析出同一基因mRNA表達量的變化趨勢和不同基因mRNA表達的先后層次。

1.2.7 抗氧化酶活性分析 用電動勻漿器分別對已得到的花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織進行勻漿。按照南京建成生物工程公司試劑盒說明書進行操作，并用吸光度法測定SOD、CAT和GPx酶活性。

1.3 數據處理

基因的mRNA表達量及抗氧化酶活力數據采用平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用 SPSS Statistics 22軟件進行單因素方差分析，采用SNK法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 Zn2+對花斑裸鯉的急性毒性影響

從表2可見：不同Zn2+濃度脅迫24、48、72、96 h時，花斑裸鯉表現出不同的死亡率，其中，1 mg/L Zn2+脅迫96 h內，花斑裸鯉未出現死亡現象；2 mg/L Zn2+脅迫48 h內，花斑裸鯉未出現死亡，脅迫72 h時出現7%的死亡率；5 mg/L Zn2+脅迫24 h時，出現26.7%的死亡率，脅迫48 h死亡率為46.6%，脅迫96 h時累積死亡率達到93.3%；10、20 mg/L Zn2+脅迫24 h時，花斑裸鯉全部死亡。

表2 不同Zn2+質量濃度下花斑裸鯉的死亡率

Zn2+對花斑裸鯉脅迫24、48、72、96 h時的LD50、LD50的95%可信限、LD50的平均可信限和安全濃度見表3，其中,LD50隨脅迫時間延長呈逐漸降低趨勢，24 h LD50最高，為5.0 mg/L，96 h LD50最低，為2.0 mg/L，其安全濃度為0.2 mg/L。

表3 Zn2+對花斑裸鯉24、48、72、96 h的LD50及安全濃度

2.2 Zn2+脅迫下抗氧化關鍵基因的表達量變化

從圖1、圖2可見：在1.0 mg/L Zn2+脅迫下，隨著脅迫時間的延長，花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化系統(tǒng)關鍵基因Nrf2、SOD、CAT和GPx的mRNA表達量均有增加，但關鍵基因表達量上調的幅度各異，表達量的變化趨勢也不完全相同；Zn2+脅迫12 h時，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表達量在鰓中上調幅度最大，分別為對照組的4.05倍和3.46倍，而它們在腎臟中的上調幅度不大；Zn2+脅迫12 h時，Nrf2表達量在肝臟中上調幅度最大，為對照組的15.11倍，而在鰓和腎臟中的上調幅度不大；Zn2+脅迫48 h時，GeCAT和GeGPx表達量在鰓中上調幅度最大，分別為對照組的7.96倍和6.56倍，而它們在腎臟和肝臟中的上調幅度不大。

標有不同大寫字母者表示同一組織不同時期間有顯著性差異(P<0.05)，標有不同小寫字母者表示同一時期不同組織間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。

圖2 Zn2+脅迫對花斑裸鯉CAT和GPx基因表達的影響

在鰓中，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT的表達量在脅迫12 h時即達到最高值，而GPx在脅迫48 h時才達到最高值；在腎臟中，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT表達量在脅迫96 h時達到最高值，而GPx在脅迫24 h時即達到最高值；在肝臟中，Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT表達量在脅迫96 h時達到最高值，而Nrf2、GPx表達量分別在12、48 h即達到最高值(圖1、圖2)。

2.3 Zn2+脅迫下各基因的應答層次分析

從圖3可見，在1.0 mg/L Zn2+脅迫下，隨著脅迫時間的延長，花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中各基因表現出不同的應答水平，并表現出組織特異性，即5種基因在3種組織中的表達量達到最高值所需要的時間各異，在3種組織中的表達量明顯上調的關鍵基因的種類各異。

圖3 Zn2+脅迫下花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟中Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx的mRNA表達量熱圖

從熱圖(圖3)分析可知：在Zn2+脅迫96 h內，花斑裸鯉鰓組織中除了Nrf2基因總體表達水平上調不明顯外，其他4個基因均有明顯上調；在腎臟中，Nrf2總體表達水平低于其他4個基因，但是5個基因的變化幅度均不大；在肝臟中，Nrf2的總體表達量低于其他4個基因，但Nrf2和Cu/Zn-SOD、Mn-SOD基因的上調幅度最大。

這表明，與3種組織中Nrf2的4個下游基因表達量相比，Nrf2表達量相對較低，尤其在腎臟和肝臟組織中表現更為明顯，但在鰓組織中，隨著脅迫時間的延長，Nrf2表達量不僅未上調反而出現下調。Cu/Zn-SOD的表達量在3種組織中上調幅度最為明顯，CAT和GPx的表達量在肝臟中上調的幅度最為明顯。

2.4 Zn2+脅迫對花斑裸鯉組織抗氧化酶活性的影響

從圖4可見,未經Zn2+脅迫的花斑裸鯉，SOD、CAT和GPx酶活性分別在鰓、肝臟和腎臟中最高，經Zn2+脅迫后3種酶在相應組織的最大值分別為對照組的1.19倍、1.90倍和1.27倍。

在Zn2+脅迫96 h之內，隨著Zn2+脅迫時間的延長，花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中SOD、CAT和GPx的酶活性均有升高，但升高幅度各異，酶活性變化趨勢也不完全相同；Zn2+脅迫后，SOD酶活性上調的幅度在腎臟中脅迫72 h最大，為對照組的2.2倍，而在鰓和肝臟中SOD酶活性達最大值的時間分別為12、24 h，分別為對照組的1.19倍和1.6倍；CAT酶活性上調幅度在鰓中脅迫96 h時最大，為對照組的2.76倍，而在肝臟和腎臟中CAT酶活性達最大值的時間分別為24、48 h，分別為對照組的2.46倍和1.99倍；GPx酶活性上調幅度在鰓中脅迫48 h時最大，為對照組的20.93倍，而在腎臟和肝臟中GPx酶活性達最大值的時間分別為24、12 h，分別為對照組的2.08倍和1.26倍(圖4)。

圖4 Zn2+脅迫對花斑裸鯉組織中抗氧化酶活性的影響

3 討論

3.1 Zn2+對花斑裸鯉的急性毒性特征

研究表明，Zn2+對體質量為(5.97±0.84)g的黃姑魚幼魚Nibeaalbiflora脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為0.752 3、0.661 6、0.561 8、0.495 9 mg/L[22]；Zn2+對七帶石斑魚Inephelusseptemfasciatus初孵仔魚脅迫24、48、72 h的半致死濃度分別為2.493、1.814、1.561 8、1.12 mg/L[23]； Zn2+對體質量為(13.10±0.30)g的錦鯉Cryprinuscarpiod脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為140、118、104、93 mg/L[24]。本試驗條件下，隨著水體中Zn2+濃度的增加，花斑裸鯉的死亡率不斷增加，Zn2+對體質量為(10±3)g的花斑裸鯉幼魚脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L，由此可見，本試驗中得到的各時段下的Zn2+半致死濃度與其他魚種存在差異，可能與魚類的種類、個體大小及對水環(huán)境中Zn2+的脅迫抵抗能力有關。本試驗結果表明，花斑裸鯉對Zn2+脅迫表現出一定的耐受性，但是其耐受能力與錦鯉相差較大。

3.2 Zn2+脅迫后抗氧化關鍵基因表達水平的變化及應答層次

肝臟、鰓和腎臟是重金屬污染魚類的主要目標器官[25]。細胞內金屬離子水平的調控機制主要包括金屬的吸收(鰓)、儲存和解毒(肝臟和腎臟)[26]。本研究中，花斑裸鯉被Zn2+脅迫96 h內，在鰓、腎和肝臟組織中抗氧化系統(tǒng)關鍵基因Nrf2、SOD、CAT和GPx的mRNA表達量均有增加，但關鍵基因表達量上調的幅度各異，這與Kim等[26]對暗紋東方鲀Takifuguobscurus和Cho等[27]對條石鯛Oplegnathusfasciatus受到重金屬Cd脅迫，Moniruzzaman等[28]對卷須鯪Cirrhinuscirrhosus受到重金屬Zn和Pb脅迫，以及斑馬魚Daniorerio[13]等魚種暴露在重金屬中的研究結果是一致的。本研究顯示，Zn2+脅迫后Nrf2表達量在肝臟中的上調幅度最大是對照組的15.11倍，而Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GPx上調幅度均在鰓中最大，這表明，各基因表達對Zn2+脅迫具有組織特異性，不同組織通過不同基因的表達產生不同的抗氧化應激應答，從而發(fā)揮不同的解毒功能。

本研究顯示，Zn2+脅迫下花斑裸鯉5種基因在3種組織中的表達量達到最高值所需要時間各異，在鰓和肝臟組織中Zn2+脅迫后，除了GPx外，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT表達量均在脅迫12 h時達到最高值，而在腎臟中除了GPx外，Nrf2、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和CAT在脅迫后達到最高值的時間均為96 h。這表明，核轉錄因子Nrf2及其下游靶基因在鰓和肝臟中最先應答，而在腎臟中最晚應答，這表明鰓和肝臟是最重要的抗重金屬離子脅迫的器官，這與Kim等[26]對暗紋東方鲀受到重金屬Cd影響的結果一致，表明肝臟具有非常強的抗氧化防御系統(tǒng)，對魚類起著關鍵的重金屬解毒作用。

整體而言，花斑裸鯉Cu/Zn-SOD的mRNA應答水平最快且最強，CAT和GPx的mRNA水平上調比較緩慢，體現出SOD的歧化作用產生了過量的H2O2，從而促進CAT和GPx的mRNA水平顯著升高，這與Giuliani等[29]對南極銀魚Pleuragrammaantarctica中的研究結果相似。

花斑裸鯉在Zn2+脅迫96 h之內，一方面3個組織中Nrf2的表達量低于4個下游基因的表達量(圖3)，另一方面在受到Zn2+脅迫后，花斑裸鯉Nrf2的轉錄水平顯著增加的趨勢與其他抗氧化因子CAT、GPx和兩個SOD的轉錄水平增加的趨勢基本一致。這一結果與對草魚Ctenopharyngodonidellus[17]受到饑餓脅迫時的研究結果相似，證實了該轉錄因子作為抗氧化劑激活因子在魚類應對應激時的重要作用，此外，還體現出Nrf2在調節(jié)魚類抗氧化防御系統(tǒng)激活中的作用來自轉錄和蛋白翻譯間的功能應答[29]。在金屬離子脅迫下核轉錄因子Nrf2的微量上調，通過細胞信號通路的級聯放大作用而使得下游靶基因明顯上調，同時通過不同基因在不同組織中的不同程度的信號放大，實現對金屬離子脅迫的整體應答。

本研究條件下，Zn2+脅迫后，花斑裸鯉的鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化系統(tǒng)關鍵基因表達量均有增加，但在各組織中表達量上調的幅度、上調達到最大量所需的時間，以及在3種組織中表現出明顯上調的基因種類都不盡相同，展示了關鍵基因應答的時間相關性和組織特異性。這表明，重金屬會誘導刺激花斑裸鯉抗氧化防御系統(tǒng)的激活，使得相關抗氧化基因的轉錄水平顯著升高，從而在分子層面揭示了魚類對重金屬的解毒機制。

研究者通常通過在不同水域設置監(jiān)測斷面，以檢測出的水體重金屬離子濃度來反映水質質量。但部分水域由于各種原因引起的某些重金屬離子濃度的瞬時升高，以及重金屬離子在水體的富集，對魚類的健康尤其是繁殖方面的影響常常被忽略。而通過檢測魚體對重金屬離子脅迫產生應答的關鍵基因的表達量，可更加直接地反映水體質量。

3.3 Zn2+脅迫對抗氧化關鍵酶活性的影響

重金屬誘導下相關酶活性水平的變化，可進一步反映重金屬脅迫下機體不同組織的應答能力。研究顯示，斑馬魚在重金屬Zn、Cd、Pb暴露下，SOD酶活性水平顯著增加[30]。在對鯉Cyprinuscarpio[11]進行Zn、Cd、Pb脅迫處理96 h后，在肝臟和腎臟中的抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性水平顯著升高。本研究中，花斑裸鯉受到Zn2+脅迫時，SOD、CAT、GPx 3種酶的活性在3種不同組織中均有不同程度的升高，酶活性達到的最高值、達到最高值的時間、酶的種類均各不相同。由此可見，在Zn2+脅迫下花斑裸鯉不同組織首先引起核轉錄因子Nrf2的上調導致相應的下游靶基因表達量升高，酶活性也相應升高，即通過從基因mRNA水平上調到酶活性提升，從而實現整體應答。以上研究表明，魚類面對重金屬危害會激活抗氧化防御系統(tǒng)，導致抗氧化基因表達量和酶活性的升高，從而保護機體免受氧化應激帶來的損傷。

4 結論

1)不同濃度、不同時間的Zn2+脅迫對花斑裸鯉幼魚的毒性作用是明顯的。以1、2、5、10、20 mg/L為Zn2+脅迫濃度, 得到Zn2+對體質量為(10±3)g 花斑裸鯉幼魚脅迫24、48、72、96 h的半致死濃度分別為5.0、3.2、2.5、2.0 mg/L，安全濃度為0.2 mg/L。

2)重金屬會誘導刺激花斑裸鯉抗氧化防御系統(tǒng)的激活，使得相關抗氧化基因的轉錄水平顯著升高，從而在分子層面揭示了魚類對重金屬的解毒機制。Zn2+脅迫下花斑裸鯉鰓、腎臟和肝臟組織中抗氧化核轉錄因子Nrf2及抗氧化酶基因SOD、CAT和GPx的轉錄水平均顯著升高，且Zn2+使得抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性升高。

3)抗氧化核轉錄因子Nrf2及其下游靶基因表達和酶活性的增加，展示了不同的脅迫應答機制，表現為應答層次上的組織特異性。這提示，可以通過檢測Zn2+脅迫的抗氧化關鍵基因及其酶活性來提前預警水體環(huán)境質量。