Slit2/Robo1與輸卵管妊娠患者輸卵管中滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)程度及血管重塑的關(guān)系

李瑩瑩，李彤，李巖，李靜雅

(沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院婦科，沈陽(yáng) 110024)

異位妊娠(Ectopic pregnancy，EP)是指受精卵在子宮體腔以外著床，是婦產(chǎn)科常見的急腹癥之一，也是早期妊娠孕產(chǎn)婦死亡的主要原因。異位妊娠約占所有妊娠的1%～2%，以輸卵管壺腹部妊娠最多見[1-2]。妊娠早期孕婦死亡最常見的原因?yàn)檩斅压苋焉锼鶎?dǎo)致的輸卵管破裂出血[3]。與胚胎植入子宮的過(guò)程一樣，輸卵管中存活的胚胎也需要局部血液供應(yīng)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管進(jìn)行血管重塑。滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管壁后，可引發(fā)一定程度的炎癥反應(yīng)[4]，炎癥反應(yīng)會(huì)損傷輸卵管上皮纖毛，擾亂輸卵管壁的組織結(jié)構(gòu)，從而損害輸卵管功能，并導(dǎo)致再次異位妊娠的風(fēng)險(xiǎn)增加。滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管的深度決定輸卵管的損害程度，然而目前尚缺乏有效的方法評(píng)估滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管壁的深度。Slit2是Slit蛋白家族成員之一，是一種分泌型糖蛋白，其與跨膜受體Roundabout(Robo)結(jié)合可對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。同時(shí)Slit2/Robo1信號(hào)傳導(dǎo)能夠促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，人絨毛膜促性腺激素可促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化、血管生成、滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲，從而有利于胚胎成功著床[7]。滋養(yǎng)層細(xì)胞與腫瘤組織具有高度相似的結(jié)構(gòu)和侵襲性，因此，本研究擬初步探索Slit2蛋白、Robo1蛋白與輸卵管妊娠中滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)程度及血管新生的關(guān)系，以期為輸卵管妊娠的臨床治療提供全新的藥物靶點(diǎn)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2018年5月至2019年3月在我院接受腹腔鏡下患側(cè)輸卵管切除術(shù)治療的74例輸卵管壺腹部妊娠患者的輸卵管樣本作為實(shí)驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合輸卵管妊娠的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；術(shù)前未接受特殊治療；肝、腎功能正常且無(wú)其他嚴(yán)重合并癥；患者及其家屬對(duì)本次研究?jī)?nèi)容知情同意。

另從同期接受手術(shù)切除治療的子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜良性病變患者獲取正常輸卵管標(biāo)本20例為正常組。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未服用過(guò)激素類藥物和放、化療；組織學(xué)檢查輸卵管均未見異常。

兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有盆腔炎性疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢腫瘤等疾病或病史；(2)雙胎或多胎；(3)非自然受孕；(4)合并甲亢、風(fēng)濕性疾病、糖尿病、高血壓、心臟病疾病等；(5)近期接受含激素相關(guān)藥物治療者。

本次研究已通過(guò)我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.標(biāo)本切取與鏡檢分組：收集術(shù)中切除的輸卵管，采用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚4 μm，取少量切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。根據(jù)滋養(yǎng)層浸潤(rùn)輸卵管的深度不同進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)[9]：滋養(yǎng)層細(xì)胞僅浸潤(rùn)輸卵管黏膜層為Ⅰ級(jí)；滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管肌層為Ⅱ級(jí)；滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)整個(gè)輸卵管壁達(dá)漿膜層為Ⅲ級(jí)(圖1)。根據(jù)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管壁的情況將實(shí)驗(yàn)組分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)組。

2.主要試劑及常規(guī)溶液配制：兔抗人Slit2單克隆抗體、兔抗人Robo1多克隆抗體、兔抗人CD34單克隆抗體(EPR2999)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；免疫組化S-P通用型試劑盒購(gòu)自丹麥DAKO公司，濃縮型DAB試劑盒、多聚賴氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)公司。自配枸櫞酸鹽緩沖液A液：0.1 mol/L枸櫞酸溶液；枸櫞酸鹽緩沖液B液：0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液。取9 ml枸櫞酸鹽緩沖液A液與41 ml枸櫞酸鹽緩沖液B液，加入450 ml蒸餾水中，配置為工作液。

A：正常；B：Ⅰ級(jí)；C：Ⅱ級(jí)；D：Ⅲ級(jí)圖1 滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管壁的組織學(xué)分級(jí)(HE染色 ×40)

3.免疫組化染色：將制好的石蠟切片置于60℃烤箱中2 h，取出切片后依次浸泡于二甲苯、無(wú)水酒精、95%酒精和75%酒精各5 min，蒸餾水沖洗后置于PBS緩沖液中。將脫蠟水化后的組織放入已沸騰的檸檬酸鹽緩沖液中，煮沸15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。余下操作按照DAB試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，Slit2和Robo1的一抗稀釋比例為1∶100，CD34一抗稀釋比例為1∶200。滴加辣根酶標(biāo)記抗兔免疫球蛋白G聚合物，置入37℃溫箱中孵育20 min。每張切片滴加新鮮配制的DAB溶液覆蓋組織，室溫下顯色3～5 min，蘇木素復(fù)染30 s，依次置于50%酒精、75%酒精、95%酒精和無(wú)水酒精中各5 min，70℃烘箱中烘干。每張切片滴加中性樹脂適量，蓋玻片覆蓋。

4.結(jié)果判定：(1)Slit2及Robo1免疫組化的結(jié)果判斷：由專業(yè)的病理人員在不知試驗(yàn)分組的前提下進(jìn)行結(jié)果的判定。陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：若著色與背景一致，得0分；若為淡黃色，得1分；若為黃色，得2分；若為棕褐色，得3分。陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：若陽(yáng)性染色細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比<10%為0分；10%～25%為1分；25%～50%為2分；≥50%為3分。兩項(xiàng)積分相加，≤2分為陰性，≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性表達(dá)數(shù)量/總數(shù)量×100%。(2)微血管密度(Microvessel density，MVD)檢測(cè)方法及判定：參照J(rèn)anik等[10]微血管密度計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)CD34免疫組化切片進(jìn)行檢測(cè)及判定。切片先在100倍視野下進(jìn)行觀察，選擇棕黃色染色最密集的3個(gè)區(qū)域，轉(zhuǎn)至400倍高倍視野下觀看并拍攝，將每個(gè)視野血管數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，相加后求得的平均數(shù)即為這張切片的MVD定量數(shù)。任何一個(gè)與周圍組織有明顯界限的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇，無(wú)論有無(wú)血管腔，均視為一個(gè)微血管。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

本研究實(shí)驗(yàn)組共納入74例，其中Ⅰ級(jí)組27例、Ⅱ級(jí)組29例、Ⅲ級(jí)組18例，正常組20例。各組間年齡及孕齡(正常組無(wú)孕齡資料)比較均無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組一般情況比較(-±s)

二、各組Slit2蛋白和Robo1蛋白表達(dá)

Slit2蛋白在實(shí)驗(yàn)組EP輸卵管組織中(包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級(jí)亞組)共有35例陽(yáng)性表達(dá)，占47.3%，在正常組輸卵管組織中有1例陽(yáng)性表達(dá)；Robo1蛋白在實(shí)驗(yàn)組中共有41例陽(yáng)性表達(dá)，占55.4%，在正常組中有2例陽(yáng)性表達(dá)。且Slit2蛋白和Robo1蛋白在Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組和Ⅲ級(jí)組的陽(yáng)性表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)，各組間有顯著差異(P<0.05)(表2)。免疫組化圖中，正常組無(wú)陽(yáng)性染色，Ⅰ級(jí)組可見淡黃色染色且陽(yáng)性染色面積較小，Ⅱ級(jí)組陽(yáng)性染色面積增大且可見黃色染色，Ⅲ級(jí)組大部分組織被染成棕褐色(圖2、圖3)。

表2 各組Slit2和Robo1蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果(%)

左側(cè)欄為各組免疫染色圖片(×200)；右側(cè)欄為左側(cè)欄各組相應(yīng)框區(qū)放大圖像(×400)圖2 各組輸卵管組織Slit2蛋白表達(dá)(免疫組化染色)

左側(cè)欄為各組免疫染色圖片(×200)；右側(cè)欄為左側(cè)欄各組相應(yīng)框區(qū)放大圖像(×400)圖3 各組輸卵管組織Robo1蛋白表達(dá)(免疫組化染色)

三、各組MVD計(jì)數(shù)比較

正常組、實(shí)驗(yàn)組輸卵管組織中(Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組和Ⅲ級(jí)組)的MVD計(jì)數(shù)，兩兩比較均有顯著差異，且浸潤(rùn)分級(jí)越高，MVD計(jì)數(shù)越大(P<0.05)(表3、圖4)。

表3 各組MVD計(jì)數(shù)比較(-±s)

四、Slit2蛋白與Robo1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明EP輸卵管組織中Slit2蛋白與Robo1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.603，P<0.001)(表4)。

表4 異位妊娠輸卵管Slit2蛋白和Robo1蛋白表達(dá)的相關(guān)性

五、Slit2蛋白和Robo1蛋白表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)的相關(guān)性

在EP輸卵管組織中，Slit2表達(dá)陽(yáng)性者M(jìn)VD計(jì)數(shù)顯著高于Slit2表達(dá)陰性者(P<0.05)；Robo1表達(dá)陽(yáng)性者M(jìn)VD計(jì)數(shù)顯著高于Robo1表達(dá)陰性者(P<0.05)(表5)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，Slit2的陽(yáng)性表達(dá)以及Robo1的陽(yáng)性表達(dá)均與MVD計(jì)數(shù)呈正相關(guān)性(rSlit2=0.846，rRobol=0.729，P<0.001)。

左側(cè)欄為各組免疫染色圖片(×200)；右側(cè)欄為左側(cè)欄各組相應(yīng)框區(qū)放大圖像(×400)圖4 各組輸卵管組織CD34-MVD計(jì)數(shù)(免疫組化染色)

表5 不同Slit2蛋白和Robo1蛋白表達(dá)情況的EP輸卵管中MVD計(jì)數(shù)比較(-±s)

討 論

近年來(lái)，隨著臨床生殖道感染、輸卵管手術(shù)、盆腔炎、輔助生殖、宮內(nèi)節(jié)育器以及流產(chǎn)等病例的不斷增加，EP發(fā)病率不斷上升并呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，其中輸卵管壺腹部妊娠始終占較大比例。O’Donnell等[11]曾報(bào)道，輸卵管妊娠以壺腹部妊娠最多見，壺腹部妊娠約占異位妊娠患者的72.5%。這也是本研究將輸卵管壺腹部妊娠作為研究對(duì)象的重要原因。近年來(lái)，由于醫(yī)療技術(shù)的逐漸發(fā)展，EP得到更及時(shí)的診斷，患者的存活率和生育力保留也有了一定程度提高。但因?yàn)檩斅压鼙谑茏甜B(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)較深，且滋養(yǎng)層細(xì)胞通常難以徹底清除，故保守治療成功率低、復(fù)發(fā)率較高[12]。從某種意義而言，了解滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)深度應(yīng)被視為對(duì)此類患者實(shí)施臨床治療的重要依據(jù)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確EP對(duì)輸卵管形態(tài)和功能的損害程度，尤其對(duì)有再次妊娠意愿的患者，選擇恰當(dāng)?shù)闹委煼桨?，從而避免切除過(guò)多的組織并改善生殖預(yù)后具有重要意義。但當(dāng)前除手術(shù)病理外，在術(shù)前能對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)深度做出客觀并有效的評(píng)價(jià)的指標(biāo)還比較匱乏。

Slit/Robo信號(hào)系統(tǒng)最早作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中軸突導(dǎo)向抑制因子而被發(fā)現(xiàn)[13]。Slit 蛋白家族成員分別較廣，不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞等正常的組織中表達(dá)，在多種腫瘤組織中也有表達(dá)[14-16]。Slit2是Slit蛋白家族成員之一，是一種分泌型糖蛋白。Slit的4種受體包括Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，皆可與Slit2結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號(hào)系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，有望成為腫瘤診斷、治療的潛在靶點(diǎn)[5]。近些年來(lái)有關(guān)Slit/Robo的研究表明，Slit/Robo信號(hào)傳導(dǎo)在生殖系統(tǒng)中仍起到了重要作用，可調(diào)節(jié)成人生殖細(xì)胞的生理功能，對(duì)子宮內(nèi)膜、卵巢及輸卵管組織的生理功能起到了重要的作用[17]。其中，Slit2/Robo1信號(hào)被認(rèn)為在妊娠期間的滋養(yǎng)層細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用。Li等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，EP輸卵管的絨毛外滋養(yǎng)層中Slit2和Robo1均有表達(dá)。在本研究中我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Slit2蛋白與Robo1蛋白在EP輸卵管組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為47.3%和55.4%，且二者的陽(yáng)性表達(dá)率均隨滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管壁的組織學(xué)分級(jí)同步增高。該結(jié)果提示Slit2蛋白、Robo蛋白的高水平表達(dá)可能預(yù)示滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)輸卵管壁的程度較深，而由此導(dǎo)致的輸卵管功能損害程度也越大。

在所有哺乳動(dòng)物的妊娠組織中都有著較豐富的血管網(wǎng)，這些新生的血管無(wú)論在正常狀態(tài)下還是在病理狀態(tài)下均受到嚴(yán)格的調(diào)控。Slit/Robo信號(hào)系統(tǒng)可通過(guò)參與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移來(lái)調(diào)控妊娠組織中的血管網(wǎng)絡(luò)。Liu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Slit/Robo信號(hào)系統(tǒng)與血管重塑有關(guān)，Slit2與Robo1蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架傳遞信號(hào)，進(jìn)而誘導(dǎo)絲狀偽足的形成，引起內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，這被認(rèn)為是血管重塑過(guò)程中的基本事件。張學(xué)敬等[20]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠月經(jīng)周期中Slit與Robo的表達(dá)也不同，其中Slit2和Robo1在小鼠卵巢組織，主要是黃體細(xì)胞中高表達(dá)，且晚期黃體Slit2和Robo1 mRNA的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；阻斷Slit/Robo信號(hào)通路后，晚期黃體細(xì)胞的凋亡率顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明Slit/Robo家族成員主要參與調(diào)控黃體細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Shen等[21]通過(guò)比較正常女性和子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)，后者Slit、Robo1表達(dá)上調(diào)，提示Slit過(guò)表達(dá)能夠誘導(dǎo)異位的子宮內(nèi)膜血管新生。此外，在哺乳動(dòng)物眼角膜及雞胚尿囊絨膜組織中，Slit/Robo均可調(diào)節(jié)血管新生，并已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[22-23]。由此可見，Slit/Robo廣泛參與了機(jī)體組織和器官的血管重塑過(guò)程。但Slit/Robo對(duì)EP輸卵管中血管重塑的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，正常輸卵管組織以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)的輸卵管組織的MVD計(jì)數(shù)逐漸升高，提示浸潤(rùn)分級(jí)越高，血管重塑越活躍。且Slit2或Robo1表達(dá)陽(yáng)性組的MVD計(jì)數(shù)高于對(duì)應(yīng)表達(dá)陰性組的MVD計(jì)數(shù)，提示血管重塑與Slit2蛋白、Robo1蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)合免疫組化等技術(shù)手段，證實(shí)了在EP輸卵管組織中，Slit2蛋白和Robo1蛋白的表達(dá)隨滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)分級(jí)的升高而增加，并提示Slit2蛋白和Robo1蛋白可能具有促進(jìn)血管新生的作用。然而本研究尚存在某些局限性，本階段試驗(yàn)還不能對(duì)Slit2/Robo1信號(hào)在輸卵管組織新生血管的進(jìn)程中差異表達(dá)的信號(hào)誘導(dǎo)機(jī)制以及促進(jìn)血管新生的機(jī)制做出解釋。此外，Slit2和Robo1蛋白在非妊娠輸卵管中也有少量陽(yáng)性表達(dá)，目前考慮Slit2和Robo1蛋白并非滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性表達(dá)，但正常妊娠是否影響輸卵管組織中Slit2和Robo1蛋白的表達(dá)、HCG的變化是否對(duì)其表達(dá)具有影響，這些疑問(wèn)將在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探明。