新型羊水細胞原位培養(yǎng)技術在產(chǎn)前診斷中的應用

郝娜，田曉彤，李萌萌，常家禎，周京，戚慶煒，蔣宇林，周希亞*，劉俊濤

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科，國家婦產(chǎn)疾病臨床研究中心，北京 100730；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100730)

羊水細胞染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的核心項目[1]。北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科遺傳實驗室從2000年開始使用原位法收獲羊水細胞，沿用至今。原位法培養(yǎng)材料種類較多，除常規(guī)的細胞培養(yǎng)瓶之外[2]，還使用過蓋玻片培養(yǎng)皿、腔式載玻片培養(yǎng)盒、盒式載玻片培養(yǎng)盒、載玻片培養(yǎng)瓶等。2018年開始，本實驗室采用新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒，并同時應用常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶進行雙線平行培養(yǎng)，分別行新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒原位法(以下簡稱載玻片原位法)收獲和常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶消化法(以下簡稱培養(yǎng)瓶消化法)收獲，即載玻片原位法、培養(yǎng)瓶消化法同時對羊水細胞培養(yǎng)收獲制片。2019年，采用兩種方法對1 568例樣本進行培養(yǎng)，比較培養(yǎng)成功率和有效的染色體核型數(shù)目，現(xiàn)總結分析如下。

資料和方法

一、研究對象

收集2019年1～12月在北京協(xié)和醫(yī)院進行產(chǎn)前診斷的1 568例孕婦的羊水樣本。產(chǎn)前診斷的指征包括高齡妊娠、血清學唐氏篩查高風險、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(Noninvasive prenatal test，NIPT)高風險、胎兒超聲異常及不良孕產(chǎn)史等。

二、儀器與試劑

1.儀器：離心機，恒溫水浴箱，二氧化碳培養(yǎng)箱，烤箱，GSL120全自動掃片系統(tǒng)、Cytovision染色體核型分析系統(tǒng)(徠卡，德國)。

2.試劑與耗材：胰酶、D-hanks溶液、新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒(上海樂辰生物)，羊水培養(yǎng)基(CHANG，美國)，秋水仙素(上海沃凱)，氯化鉀、枸櫞酸鈉、冰乙酸(北京國藥)，Trypsin-EDTA(Gibco，美國)，Giemsa染液(Sigma，美國)，常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶(Corning，美國)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

三、研究方法

1.標本采集：孕16～22+6周時，在B超引導下行經(jīng)腹羊膜腔穿刺術，將15～20 ml羊水分別置于2個15 ml無菌離心管中，運送至實驗室。

2.接種：羊水兩管，平衡離心2 000 rpm×10 min，各管吸掉部分上清后留取1 ml混懸細胞，一管細胞加入2 ml羊水培養(yǎng)基，吹打混勻后直接接種在卡扣式載玻片培養(yǎng)盒；另一管細胞加入4 ml相同羊水培養(yǎng)基，吹打混勻后接種至塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.換液：培養(yǎng)5～7 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，細胞集落>5個/瓶，鏡下可見透亮細胞較多時，倒出原培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至另一塑料培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)備用。在原卡扣式載玻片培養(yǎng)盒及塑料培養(yǎng)瓶中分別加入新鮮培養(yǎng)液4 ml，并于次日進行收獲處理。

4.收獲：(1)載玻片原位法收獲：每盒加入秋水仙素工作液100 μl(終濃度為0.25 μg/ml)，37℃培養(yǎng)箱孵育，45 min后吸掉培養(yǎng)液，加入預溫的5 ml低滲液(0.2%氯化鉀+0.2%枸櫞酸鈉)，37℃培養(yǎng)箱低滲。25 min后加入1 ml 固定液(甲醇：冰乙酸按3∶1體積比配制)，室溫固定5 min。清除培養(yǎng)盒內(nèi)液體，加入固定液4 ml，室溫固定15 min。重復一次固定步驟，打開塑料卡扣，將載玻片從塑料方框上分拆下來，置烤片機上烤干后收入玻片架，80℃烤片3 h。(2)培養(yǎng)瓶消化法收獲：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素工作液100 μl(終濃度為0.25 μg/ml)，置于37℃水浴箱中孵育15 min。將羊水上清液倒入離心管中，并在培養(yǎng)瓶中加入3 ml 0.05% Trypsin-EDTA，置于37℃水浴箱中孵育15 min。培養(yǎng)液終止消化，用吸管用力吹打細胞面，倒入離心管中，2 000 rpm離心5～10 min；棄上清，加入5 ml低滲液，吹打混勻后置入37℃水浴箱中孵育15 min；加入1 ml固定液，輕輕混勻，靜置5 min，2 000 rpm離心10 min；棄上清，加入5 ml固定液，輕輕混勻，室溫下作用15 min；2 000 rpm離心10 min后棄上清液。重復上述步驟，15 min后離心棄上清，依據(jù)細胞沉淀量調(diào)配懸液，在玻片上滴加2～3滴懸液，盡量保證懸液平鋪在載玻片上。置烤片機上烤干后收入玻片架，80℃烤片3 h。

5.閱片分析：以人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 2016)G顯帶400條帶水平為標準分析染色體核型，使用Cytovision分析系統(tǒng)掃描并采集圖像，計數(shù)原位收獲載玻片中至少5個克隆，分析5個細胞，核型配對2個細胞。計數(shù)消化收獲載玻片中至少10個細胞，分析5細胞，核型配對2個細胞[3]。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般情況

本研究共納入1 568例孕婦，年齡19～48歲，平均年齡(34.9±4.5)歲，孕周為16～22+6周，平均孕周(18.6±1.8)周。產(chǎn)前診斷指征見表1。

表1 1 568例受檢者產(chǎn)前診斷指征

二、不同孕周組別培養(yǎng)結果比較

按不同孕周分組分別統(tǒng)計不同培養(yǎng)方法的成功率和失敗率。1 568例羊水樣本均為雙線培養(yǎng)及制片，其中常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)時有2例細菌污染，培養(yǎng)成功率99.87%(1 566/1 568)。新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒培養(yǎng)時有3例細菌污染，同時有2例因卡扣式培養(yǎng)盒密封處理不合格導致漏液，培養(yǎng)成功率99.68%(1 563/1 568)。兩種方法的總培養(yǎng)成功率無顯著差異(P=0.26)(表2)。

表2 不同孕周羊膜腔穿刺后羊水培養(yǎng)結果比較(%)

三、培養(yǎng)條件及有效核型比較

常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶法所獲得的貼壁細胞集落、可計數(shù)核型及可分析核型多于卡扣式培養(yǎng)盒法。但在培養(yǎng)液用量、培養(yǎng)時長、收獲操作時間上，卡扣式培養(yǎng)盒法都要優(yōu)于常規(guī)塑料瓶培養(yǎng)法(表3)。

表3 兩種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)條件及獲得有效核型情況比較(-±s)

四、染色體核型分析

1 568例樣本中共發(fā)現(xiàn)98例異常核型，包括30例結構異常和68例數(shù)目異常。數(shù)目異常包括29例21三體、12例18三體、2例9號三體嵌合、25例性染色體數(shù)目異常；染色體嵌合共8例，1例為結構異常嵌合，其余7例均為數(shù)目異常嵌合。

討 論

近年來，隨著分子生物學技術的迅猛發(fā)展，新技術不斷被引入到臨床應用中，產(chǎn)前診斷向更精確、更快速的方向發(fā)展，但染色體核型分析依然是產(chǎn)前診斷領域無可替代的重要手段，尤其對于嵌合體、平衡易位、復雜易位、倒位等染色體異常的檢出具有重要意義。在我國，羊水細胞培養(yǎng)及染色體核型分析依然是絕大多數(shù)產(chǎn)前診斷中心的常規(guī)診斷方法。因此，提高細胞培養(yǎng)質(zhì)量、獲得滿意的核型以供分析，對確保羊水產(chǎn)前診斷的準確性至關重要。

細胞遺傳學領域中多種培養(yǎng)方式及全自動掃片系統(tǒng)、智能分析軟件已廣泛使用，在緩解技師鏡下閱片壓力的同時，提高了異常檢出率及工作效率。核型分析自動化推動著前期培養(yǎng)及收獲流程方法的改進。據(jù)文獻報道，我國產(chǎn)前診斷實驗室大部分均使用消化法進行收獲處理，無法區(qū)分單細胞來源或多細胞來源[4-6]。少數(shù)實驗室使用載玻片盒羊水細胞培養(yǎng)法，即原位法收獲細胞[7-9]，雖可鑒別細胞來源，但在接種環(huán)節(jié)中需要注意，首次接種要將羊水細胞懸液滴加在載玻片表面，不要溢出，以避免丟失細胞，并需在24 h后追加2～3 ml新鮮培養(yǎng)液。該方法通常采用普通載玻片培養(yǎng)盒，多次操作有增加污染的可能。因此，本研究對新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒進行了實驗研究。

高質(zhì)量染色體核型可以提高產(chǎn)前診斷準確率，每一個操作環(huán)節(jié)都會影響染色體核型質(zhì)量[10]。本實驗室多年來一直采用原位法培養(yǎng)細胞，并不斷探索不同培養(yǎng)器皿及方法的成功率、獲得核型情況及培養(yǎng)條件。首先，原位培養(yǎng)具有保留細胞克隆性、可追溯羊水中多胚層來源的細胞性質(zhì)、且對嵌合體診斷具有明顯的優(yōu)勢[11]。本研究共發(fā)現(xiàn)8例染色體數(shù)目或結構嵌合，嵌合比例均從新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)盒的原位培養(yǎng)系統(tǒng)中獲得。相對準確的嵌合比例可以給臨床診斷提供依據(jù)，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供必要的的實驗室信息[12]。其次，常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶與新型(卡扣式)培養(yǎng)盒同步培養(yǎng)羊水細胞，兩種培養(yǎng)材料的培養(yǎng)成功率無顯著差異。常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶因培養(yǎng)瓶底部面積大，所獲得的貼壁細胞集落、可計數(shù)核型及可分析核型多于載玻片原位法。但在培養(yǎng)時間、培養(yǎng)液用量上，載玻片原位法均占優(yōu)勢。載玻片原位法使用的載玻片為玻璃材料，玻璃表面具有天然的正電荷，使細胞更容易貼壁生長。貼附生長細胞的生長過程要經(jīng)過3個階段：潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期。羊水細胞培養(yǎng)至6～7 d時已處于指數(shù)生長期，大量細胞進入分裂期[13]。本研究選擇第5天換液處理，24 h后根據(jù)細胞生長狀態(tài)進行收獲制片。細胞收獲流程結束打開塑料卡扣，將載玻片從塑料方框上分拆下來，直接將載玻片進行短暫熏蒸。在載玻片固定液蒸發(fā)過程中，染色體因吸水而顯著膨脹，這是染色體伸長、染色體中期擴散以及高分辨率帶紋出現(xiàn)的先決條件[14]。為了得到高質(zhì)量的染色體核型，培養(yǎng)瓶消化法在滴片前需對玻片清潔并進行熏蒸處理，滴片過程中仔細觀察水分蒸發(fā)情況并在滴片時轉(zhuǎn)換樣本標簽。載玻片原位法收獲過程中沒有滴片步驟，可以減少此類錯誤的發(fā)生；另外，載玻片原位法培養(yǎng)的細胞一般在培養(yǎng)第7天即可收獲制片，特殊病例可以在10 d內(nèi)得到染色體核型結果，相比于培養(yǎng)瓶消化法培養(yǎng)第9天才可進行收獲相關操作，縮短了產(chǎn)前診斷報告的發(fā)放時間。

產(chǎn)前診斷指征中，對于唐氏篩查高風險及NIPT高風險病例，相關指南規(guī)定均需有創(chuàng)操作獲取胎兒樣本進行產(chǎn)前診斷[15-17]。由于唐氏篩查及NIPT的檢測孕周大多在中孕早期，高風險病例獲得結果時往往不足18周甚至不足17周。本研究統(tǒng)計了小于孕18周的病例數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)方法的培養(yǎng)成功率及有效核型數(shù)目均與孕18～20周組一致。因此對于篩查高風險病例，可以適當提前穿刺時間。而對于超聲異常的胎兒，產(chǎn)前診斷中微陣列分析及測序技術逐步被大家認可[18-19]，但仍需羊水細胞染色體核型分析除外結構異常[20]。本研究中對胎兒超聲異常或不良孕產(chǎn)史的孕婦分別留取10 ml羊水送檢微陣列分析，15 ml羊水行染色體核型分析。因此雙線培養(yǎng)僅允許分別將6 ml和9 ml羊水的沉淀細胞分別接種于新型(卡扣式)培養(yǎng)盒和常規(guī)塑料瓶。在羊水量僅為6 ml的情況下，載玻片原位法的有效核型多于培養(yǎng)瓶消化法，所獲得的染色體核型有效解決了對染色體結構的判斷。胎兒本身是否存在染色體結構變異對其決定此次妊娠結局及再次妊娠均有指導意義[21]。

本研究7例培養(yǎng)失敗的病例中，5例為污染，不除外操作因素及耗材本身消毒問題。載玻片原位法2例漏液的病例原因為新型(卡扣式)培養(yǎng)盒密封問題，經(jīng)和廠家溝通后再無此種情況發(fā)生。

綜上所述，新型(卡扣式)載玻片培養(yǎng)法具有操作步驟簡單、耗材用量少、羊水需求量小、可相應提前產(chǎn)前診斷時間等優(yōu)勢，對于嵌合體的嵌合比例確定可能具有優(yōu)勢，可以與常規(guī)塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法結合，提高羊水細胞染色體核型分析的效率。兩種方法同時處理羊水細胞，可以及時有效地解決大片段結構異常及確定嵌合體比例，適合臨床使用。