1例摩氏摩根菌引起B(yǎng)ALB/c小鼠感染的診治

鄒 玲，孔垂民，殷 茵，劉煥奇，劉文華

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

摩氏摩根菌為兼性厭氧的革蘭陰性桿菌，能夠誘導(dǎo)β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)多種抗生素具有抗性。該菌廣泛存在于自然界、人及多種動(dòng)物的胃腸道中，為條件致病菌，可引起人獸感染[1]。1980年在人膝關(guān)節(jié)炎病例中首次發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌[2]，對(duì)于其引起感染的報(bào)道主要集中在人的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心包炎和眼內(nèi)膜炎等炎癥病例中[3]，關(guān)于動(dòng)物感染的報(bào)道較少。近來在水產(chǎn)動(dòng)物研究中有摩氏摩根菌感染的報(bào)道[4-5]。Zhao等首次報(bào)道雞感染摩氏摩根菌引起群體死亡[6]。但未見有關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大范圍感染摩氏摩根菌的報(bào)道。BALB/c小鼠為近交系小鼠，具有遺傳基因純、個(gè)體差異小等特點(diǎn)，是生命科學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本試驗(yàn)對(duì)2018年11月某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的一批消瘦、被毛粗亂的BALB/c小鼠進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源及主要試劑 某實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的疑似患病BALB/c小鼠10只、健康的BALB/c小鼠20只。PCR試劑，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 送檢BALB/c小鼠的臨床診斷 對(duì)送檢的BALB/c小鼠進(jìn)行斷頸處死，經(jīng)浸泡消毒后進(jìn)行剖檢。

1.3 細(xì)菌的分離與鏡檢 無菌操作對(duì)剖檢發(fā)現(xiàn)有明顯病變的肝臟及腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行細(xì)菌的分離，接種于普通營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基及SS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，取單菌落進(jìn)行三代純化。挑取純化好的單菌落進(jìn)行革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.4 細(xì)菌的16S rRNA基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中搖菌12 h作為PCR反應(yīng)的模板，利用16S rRNA基因的通用引物27F和907R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期目的條帶為900 bp。反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 15 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 12 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min； 94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，將與目的條帶一致的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì)，從GenBank中下載同源性較高序列，利用MEGA 7.0中的最大簡(jiǎn)約法制作進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。

1.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 以109CFU/mL的分離菌菌液分別經(jīng)腹腔注射和灌胃途徑各攻毒5只健康BALB/c小鼠，每只0.2 mL，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，相同條件下進(jìn)行隔離飼養(yǎng)觀察。

1.6 藥敏試驗(yàn) 為了篩選敏感藥物以對(duì)疾病進(jìn)行有效控制，采用常規(guī)的藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)《歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性，選擇敏感藥物進(jìn)行治療。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理變化 剖檢病變小鼠可見，小鼠的肝臟腫大，表面遍布出血點(diǎn)(中插彩版圖1A)，腸系膜淋巴結(jié)顯著腫大、瘀血，腸道可見出血點(diǎn)(中插彩版圖1B)。 脾臟淤血呈暗紅色(中插彩版圖1C)。

圖1 患病小鼠剖檢器官病變A: 肝臟腫大、出血; B: 腸系膜淋巴結(jié)腫大、淤血; C: 脾臟呈暗紅色

2.2 細(xì)菌的分離與鏡檢 無菌操作對(duì)發(fā)病鼠進(jìn)行細(xì)菌分離。經(jīng)24 h培養(yǎng)，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂和SS瓊脂中均有菌落長(zhǎng)出，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落呈灰白色、不透明，在光照下有淡綠色光澤。在SS平板上為無色、透明、圓形菌落。純化細(xì)菌經(jīng)染色鏡檢可見兩端鈍圓的革蘭陰性小桿菌。

2.3 細(xì)菌的16S rRNA基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 使用16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到了預(yù)期900 bp左右的單一目的條帶(圖2)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)，顯示分離菌株與摩氏摩根菌(序列號(hào)為JX049341.1)有99%同源性，可確認(rèn)分離細(xì)菌為摩氏摩根菌。

圖2 PCR電泳檢測(cè)結(jié)果M：DL2 000 marker； 1：陰性對(duì)照； 2：臨床分離株

在GenBank下載與分離菌株同源性較高的基因序列，利用MEGA 7.0制作進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析。由圖3可知，本試驗(yàn)分離菌株與在大鯢分離到的基因號(hào)為JX049341.1的摩氏摩根菌同源性最高，可達(dá)66%。

圖3 分離菌的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹注：框內(nèi)為本試驗(yàn)分離菌株

2.4 攻毒試驗(yàn) 腹腔注射組小鼠于攻毒17 h后全部死亡，剖檢可見攻毒小鼠肝臟、脾臟嚴(yán)重出血、淤血，腸系膜腫大、出血，與臨床發(fā)病小鼠癥狀一致。灌胃組小鼠于攻毒18 h后開始出現(xiàn)精神沉郁現(xiàn)象，28 h全部死亡，剖檢癥狀同上。對(duì)照組小鼠健康存活。綜合細(xì)菌鑒定和攻毒試驗(yàn)結(jié)果，確診此次疫情由摩氏摩根菌引起。

2.5 藥敏試驗(yàn) 紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，分離菌株的耐藥率達(dá)75%，僅對(duì)新霉素、鏈霉素、左氧氟沙星、氟苯尼考敏感。

表1 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

2.6 治療效果 根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)考慮藥物間的協(xié)同作用和藥物代謝途徑等因素，選擇新霉素和氟苯尼考進(jìn)行聯(lián)合用藥，同時(shí)加強(qiáng)了通風(fēng)換氣和環(huán)境消毒，結(jié)果大群在用藥2 d即表現(xiàn)出明顯好轉(zhuǎn)，連續(xù)用藥5 d完全控制了病情，鼠群恢復(fù)了健康。

3 討論

根據(jù)養(yǎng)殖場(chǎng)中BALB/c小鼠的發(fā)病情況及臨床剖檢癥狀，初步判定該養(yǎng)殖場(chǎng)存在傳染性疾病，通過細(xì)菌的分離鑒定及動(dòng)物回歸試驗(yàn)，確診了疫情是由摩氏摩根菌引起。摩氏摩根菌是一種人獸共患病病原菌，該菌主要引起多種炎癥反應(yīng)及實(shí)質(zhì)器官充血、出血[7]。根據(jù)剖檢癥狀可知，本試驗(yàn)分離到的摩氏摩根菌主要侵害小鼠的肝臟、脾臟及腸道等臟器。

動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，通過腹腔注射及灌胃2種攻毒途徑均可引起小鼠死亡，腹腔注射組攻毒13 h即出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象，剖檢顯示內(nèi)臟器官出血、充血現(xiàn)象明顯，說明分離的菌株毒力很強(qiáng)，灌胃組的剖檢與臨床發(fā)病小鼠癥狀基本一致，說明該菌很可能經(jīng)消化道途徑感染。16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，本試驗(yàn)分離菌株與2012年在四川成都的患病大鯢體內(nèi)分離的基因號(hào)為JX049341.1的摩氏摩根菌在同一分支，進(jìn)一步說明該菌分布廣泛，致病力強(qiáng)。

選用針對(duì)革蘭陰性菌的16種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，分離菌株耐藥性很強(qiáng)，僅對(duì)新霉素、氟苯尼考等4種藥物敏感。摩氏摩根菌能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物具有一定的抗性[8]，但有報(bào)道表明摩氏摩根菌對(duì)部分頭孢類藥物敏感[9]，這可能與不同菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的種類活性不同有關(guān)。新霉素內(nèi)服很少吸收，便于對(duì)腸道病原菌產(chǎn)生殺菌作用；氟苯尼考吸收快，分布廣，能夠較長(zhǎng)時(shí)間維持有效血藥濃度，利于殺滅侵入內(nèi)臟器官的細(xì)菌，2種藥物聯(lián)合使用有利于對(duì)疾病及時(shí)有效控制。

摩氏摩根菌作為機(jī)會(huì)致病菌只有在宿主抵抗力降低的條件下才會(huì)引起發(fā)病，BALB/c小鼠作為近交系小鼠遠(yuǎn)比不上昆明系等實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，其發(fā)病與養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)。經(jīng)了解該養(yǎng)殖場(chǎng)BALB/c小鼠養(yǎng)殖車間存在養(yǎng)殖密度大，通風(fēng)不良導(dǎo)致氨味濃重以及消毒不徹底等問題，這些因素會(huì)導(dǎo)致小鼠抵抗力下降，從而增加病原易感性，所以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)要遵循動(dòng)物福利基本要求，首先為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境，保持適宜的溫度、濕度和合理的飼養(yǎng)密度，加強(qiáng)通風(fēng)換氣和環(huán)境消毒頻率，確保墊料衛(wèi)生并及時(shí)更換，重視飼料營(yíng)養(yǎng)水平，提高機(jī)體免疫力，從而降低患病機(jī)率。