王 娟,姜忠玲,叢 霞,曹榮峰,田文儒,豐艷妮,李華濤
(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109)
鈣是奶牛體內(nèi)不可或缺的常量無機元素,參與體內(nèi)多種生理過程[1],如凝血、骨生成[2]、肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)以及能量代謝[3]等,并發(fā)揮著十分重要的作用。當(dāng)奶牛受到各種因素的影響,致使其體內(nèi)的鈣濃度變化超出自身的調(diào)節(jié)范圍時,就會引起鈣代謝紊亂。尤其是圍產(chǎn)期奶牛因妊娠和泌乳導(dǎo)致鈣大量流失[4],極易引發(fā)低鈣血癥。目前,臨床上對奶牛圍產(chǎn)期低鈣血癥的檢測多依賴于血清生化指標(biāo),但由于個體差異的原因,不同奶牛對血鈣濃度變化范圍耐受程度不同,血清生化指標(biāo)并不能準(zhǔn)確的預(yù)測低鈣血癥的發(fā)生與發(fā)展,也無法準(zhǔn)確判定亞臨床型低鈣血癥。因此,找出更為靈敏且精準(zhǔn)判定奶牛圍產(chǎn)期低鈣血癥的生物標(biāo)志物將有重要的應(yīng)用價值。隨著測序技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-seq)技術(shù)作為一種新興技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域,其測序結(jié)果也在后續(xù)研究中相繼被證實。雖然目前RNA-seq技術(shù)仍存在一些不足,但其具有篩選范圍廣、精度高、成本低、無損檢測等特點,仍是臨床發(fā)掘疾病生物標(biāo)志物不可取代的手段。
本研究擬篩選低鈣培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞(Cow mammary epithelial cells, CMEC)差異表達基因,為臨床尋找更為準(zhǔn)確、靈敏的奶牛低鈣血癥生物標(biāo)志物提供方法與思路。
1.1 細(xì)胞來源及處置 本實驗室凍存的自行培養(yǎng)并且已經(jīng)鑒定的CMEC細(xì)胞系,將細(xì)胞分為低鈣培養(yǎng)組(DE)及空白對照組(DP),提取總RNA后用于后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)錄組測序每組設(shè)3個重復(fù),定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)驗證每組,設(shè)9個重復(fù)。
1.2 試劑 TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2 000 DNA marker、TB GreenTMpremix ExTMTaqⅡ熒光染料,均購自TaKaRa公司;焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, EGTA]、青鏈霉素混合液(雙抗,100×)、50×TAE緩沖液,均購自Solarbio公司;D-MEM/F-12培養(yǎng)基,購自Gibco公司(使用時添加10%胎牛血清和1%雙抗);胎牛血清,購自ExCell Bio公司;鈣試劑盒(微板法)及CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒,均購自南京建成生物研究所;PBS緩沖液用DEPC處理過的水配制;EASY spin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒,購自艾德萊生物有限公司;Kadaq 2×PCR Master Mix,購自Abm公司;引物由青島派諾森基因科技有限公司合成;其余未特別指明的生化試劑,均購自Sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 依他酸(EGTA)濃度篩選及CMEC低鈣培養(yǎng) 將經(jīng)復(fù)蘇后培養(yǎng)的CMEC隨機分為空白對照(DP)、0.5 mmol/L EGTA(DE1)、1.0 mmol/L EGTA(DE2)和2.0 mmol/L EGTA(DE3)組,分別培養(yǎng)24、48 h和72 h后鏡檢觀察細(xì)胞生長狀態(tài),并用Toup View軟件拍照記錄。按照鈣試劑盒說明書對4個分組的培養(yǎng)基進行Ca2+濃度測定。按照CCK-8檢測試劑盒說明書分別于培養(yǎng)后24~144 h檢測細(xì)胞活力(每隔24 h檢測1次),以造成細(xì)胞生長明顯抑制且不造成細(xì)胞大量凋亡為標(biāo)準(zhǔn)選擇低鈣培養(yǎng)濃度。
1.3.2 CMEC的轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析 選取生長狀態(tài)良好,細(xì)胞量>5×106個的DP組和DE2組CMEC,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,加入1 mL TRIzol試劑反復(fù)吹打,至溶液澄清度均一后,移入凍存管中,分別標(biāo)記為DP和DE,密封后于-80 ℃保存,將制備好的樣品保存于干冰中送公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。將測序獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Raw reads),過濾后得到Clean reads,后續(xù)的數(shù)據(jù)分析都基于Clean reads。將Clean reads與參考基因組的序列進行對比,得到基因的表達量,經(jīng)分析后獲得差異表達基因。最后對基因功能進行注釋及GO、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。
1.3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序的qRT-PCR驗證
1.3.3.1 測序樣品制備 按照RNA提取試劑盒說明書從低鈣組及對照組細(xì)胞中提取總RNA。用Eppendrof 蛋白質(zhì)核酸定量儀檢測提取的總RNA濃度,A260/A280和A260/A230值均在2.0以上時可用于后續(xù)試驗。將提取的總RNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3.2 引物合成 使用牛β-actin為參考基因,從測序結(jié)果中篩選8個差異表達顯著性基因,參照美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)公布的基因序列,采用NCBI官網(wǎng)的Primer-BLAST進行引物設(shè)計,序列見表1。
表1 qRT-PCR驗證基因的引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR in the study
1.3.3.3 反轉(zhuǎn)錄及核酸電泳驗證 按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制10 μL gDNA去除體系,根據(jù)RNA提取濃度,保證體系中含有1 μg RNA,震蕩混勻后離心5~10 s,于42 ℃孵育2 min。配制反轉(zhuǎn)錄擴增體系,加入gDNA去除后的RNA,漩渦混勻、離心后,于PCR儀中37 ℃孵育15 min、85 ℃孵育5 s 后得到cDNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩J褂忙?actin引物,配制10 μL PCR擴增體系,對cDNA進行PCR擴增。PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共29個循環(huán);72 ℃再延伸7 min,最后4 ℃孵育。核酸電泳對擴增的cDNA進行驗證,每組設(shè)9個重復(fù)。電泳結(jié)束后,在凝膠成像系統(tǒng)下進行觀察并保存圖像。
1.3.3.4 qRT-PCR驗證 配制20 μL qRT-PCR擴增體系,按照Light Cycler?96 SW熒光定量PCR儀操作說明書,對所選8個差異基因進行qRT-PCR驗證。以β-actin為參考基因,采用2-ΔΔCt方法對所測基因mRNA的相對表達情況進行分析。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,組間采用單因素方差分析,計算Log2FC值后與RNA-seq測序結(jié)果進行差異倍數(shù)比較。
2.1 EGTA濃度篩選及CMEC低鈣培養(yǎng) 采用不同Ca2+濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞24 h后,DE1、DE2組與DP組間無明顯差異,而DE3組明顯可見大量細(xì)胞皺縮成圓形亮點,細(xì)胞質(zhì)空泡化,核質(zhì)凝縮。培養(yǎng)48 h及72 h后,DE1組較DP組無明顯肉眼可見變化,DE2組細(xì)胞較DP組細(xì)胞生長緩慢,并有少量細(xì)胞凋亡,DE3組細(xì)胞開始大量凋亡脫落(中插彩版圖1)。
圖1 不同Ca2+濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)后24、48 h和72 h的奶牛乳腺上皮細(xì)胞 (40×)Fig.1 Bovine mammary epithelial cells cultured within different concentrations of Ca2+ for 24, 48 h and 72 h
采用鈣試劑盒分別對DP、DE1、DE2組和DE3組培養(yǎng)基進行Ca2+濃度檢測發(fā)現(xiàn),4個組鈣離子濃度分別為1.02、0.87、0.43 mmol/L和0.03 mmol/L。CCK-8結(jié)果顯示,與DP組相比,DE1、DE2、DE3組對CMEC的生長均有抑制作用,DE1組與DE2組細(xì)胞在48 h存活率明顯上升,72 h存活率下降,之后逐漸趨于平穩(wěn)(圖2)。DE3組細(xì)胞的生長受到顯著抑制,且隨著培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞逐漸凋亡。據(jù)此,將選取DE2組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)試驗。
圖2 不同Ca2+濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)后奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活率Fig.2 Effects of different concentrations of Ca2+ on survival rate of bovine mammary epithelial cells
2.2 CMEC的轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析
2.2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析 根據(jù)DP組和DE組的堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿基質(zhì)量分布,不論是正向測序還是反向測序,其堿基質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%以上集中于30%~40%,說明其錯誤率控制在0.1%~0.01%。DP組和DE組的GC含量大多集中在40%~50%,說明在建庫過程中序列是隨機打斷的且測序文庫的質(zhì)量良好。通過Hisat 2軟件將所測序列與參考基因組Bos taurus進行比對,其比對率均達96%以上(表2),說明所選參考基因組合適,且樣品可滿足后續(xù)分析的需求。
表2 參考基因組比對統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of comparison with reference genome
2.2.2 差異表達基因數(shù)據(jù)分析 以差異倍數(shù)∣log2(Fold change,FC)∣≥1 及顯著水平P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)篩選DE組與DP組之間的差異表達基因,共計得到顯著差異表達基因116個,其中52個表達上調(diào)基因,64個表達下調(diào)基因(見中插彩版圖3A)。對2組的差異表達基因進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)其主要集中于三大類30個小類中,主要參與了染色質(zhì)構(gòu)型、細(xì)胞內(nèi)組成、染色質(zhì)結(jié)合等(中插彩版圖3B)。差異表達基因大多富集于硫代謝、硫中繼系統(tǒng)、病毒致癌作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等信號通路(中插彩版圖3C),根據(jù)富集結(jié)果,以與鈣平衡調(diào)節(jié)相關(guān)的甲狀腺素信號通路和甲狀腺素合成通路為例,查找到差異表達上調(diào)基因KAT2A和差異表達下調(diào)基因DUOXA2。甲狀腺素相關(guān)通路對機體鈣水平調(diào)節(jié)具有重要意義,該差異基因可能與細(xì)胞受低鈣環(huán)境培養(yǎng)有關(guān)。
圖3 兩組間差異表達基因分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes between the two groupsA:火山圖,圖中一個點代表一個基因,紅點為上調(diào)基因,藍點為下調(diào)基因;B:GO富集分析圖; C:KEGG通路富集分析圖,圖中點越大代表所富集的基因數(shù)量越多,顏色越深代表P值越小A: Volcano plot, a dot in the diagram represents a gene, red dot represents up-regulated gene, blue dot represents down-regulated gene;B: GO enrichment analysis diagram; C: KEGG pathway enrichment analysis diagram. The larger the dot in the picture, the more genes are enriched. The darker color, the lower P value.
2.3 CMEC轉(zhuǎn)錄組測序的qRT-PCR驗證
2.3.1 樣品的qRT-PCR檢測 經(jīng)蛋白質(zhì)核酸定量檢測儀檢測,提取的DP組和DE組總RNA濃度均在440 ng/μL以上,且A260/A280、A260/A230值均>2.0,提取質(zhì)量優(yōu)良。以參考基因β-actin為引物進行cDNA的PCR擴增反應(yīng),核酸電泳對擴增產(chǎn)物進行驗證。結(jié)果可得,產(chǎn)物均在250 bp左右,可初步判斷產(chǎn)物為β-actin片段。2組及其重復(fù)均可見較亮的條帶(圖4),可用于后續(xù)試驗。
圖4 cDNA擴增結(jié)果Fig.4 Amplification results of cDNAM:DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); DP-W:空白對照; DE-W:低鈣培養(yǎng)組M: DL-2 000 DNA marker; DP-W: Blank control; DE-W: Low calcium medium group
2.3.2 篩選基因的qRT-PCR驗證 將qRT-PCR結(jié)果經(jīng)計算后與RNA-seq測序結(jié)果的差異倍數(shù)Log2FC進行比較,7個基因與RNA-seq測序結(jié)果相符,有1個 基因與測序結(jié)果不符(圖5)。說明RNA-seq測序結(jié)果較為可靠,準(zhǔn)確性較高。
圖5 RNA-seq與qRT-PCR差異倍數(shù)比較Fig.5 Comparison of differential multiples between RNA-seq and qRT-PCR
圍產(chǎn)期低鈣血癥是奶牛常見的鈣代謝紊亂性疾病,處于低鈣血癥狀態(tài)的奶牛常因免疫力低下而誘發(fā)子宮復(fù)舊不全、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下、乳房炎[5-8]和真胃變位[8],同時還會影響奶牛的生產(chǎn)性能[9-12],對于分娩后的奶牛來說,大量的鈣隨乳汁流逝更易引發(fā)低鈣血癥。泌乳期CMEC在調(diào)節(jié)鈣的轉(zhuǎn)運以及維持胞內(nèi)鈣平衡等方面起重要作用[13],但其具體機制尚不明確。目前,已有研究人員利用RNA-seq技術(shù)對動物[14]、植物[15-16]等在遭受外界刺激后的轉(zhuǎn)錄組進行測序,從而發(fā)現(xiàn)了相關(guān)差異表達基因,為動物、植物遭受外界應(yīng)激后相關(guān)分子機制的研究奠定了基礎(chǔ)。人醫(yī)中也有利用該技術(shù)用于疾病診斷[17]以及尋找疾病生物標(biāo)志物的相關(guān)報道[18-20]。對于低鈣血癥的檢測臨床多依賴于血清生化指標(biāo),但取血時操作不當(dāng)易引發(fā)應(yīng)激、細(xì)菌感染等問題,十分不便。故本研究選用CMEC為研究對象,利用RNA-seq技術(shù)研究低鈣培養(yǎng)對CMEC基因表達水平的影響,篩選差異表達基因,以研究該細(xì)胞應(yīng)對低鈣環(huán)境的分子機制,以期尋找到可經(jīng)乳汁中乳腺上皮細(xì)胞檢測圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥的生物標(biāo)志物。
經(jīng)差異表達基因GO富集分析及KEGG通路分析顯示,低鈣培養(yǎng)可影響細(xì)胞的基因表達,且2組間差異表達基因富集于多個通路之中,以與鈣調(diào)節(jié)相關(guān)的甲狀腺通路為例查找到富集基因KAT2A和DUOXA2。甲狀腺激素主要作用于骨骼,能夠調(diào)節(jié)骨骼的新陳代謝,影響骨骼的重建過程,促進破骨細(xì)胞的活性發(fā)生改變,使骨吸收過程大于骨形成過程[21],可通過增加尿液中的鈣含量和糞鈣的排出量來調(diào)節(jié)機體的鈣平衡。KAT2A和DUOXA2基因分別指導(dǎo)賴氨酸乙?;D(zhuǎn)移酶和雙氧化酶成熟因子的合成。賴氨酸乙?;D(zhuǎn)移酶是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的一種,其可作為轉(zhuǎn)錄激活因子將乙?;鶑囊阴]o酶A中轉(zhuǎn)移到特定組蛋白氨基末端的賴氨酸上,使與該段結(jié)合的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)變疏松,利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。有研究表明,KAT2A基因可通過經(jīng)典Wnt通路調(diào)節(jié)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化作用,且與之呈正相關(guān),KAT2A表達水平降低可使細(xì)胞的成骨分化能力減弱,使牙齒骨量減少[22-23]。甲狀腺素是由TPO在H2O2的參與下經(jīng)催化碘的有機化、酪氨酸碘化以及碘化酪氨酸耦聯(lián)等過程生成的,雙氧化酶2與H2O2的生成有關(guān),雙氧化酶成熟因子2則主要起協(xié)助雙氧化酶2蛋白轉(zhuǎn)運、成熟以及定位的作用[24]。本研究中KAT2A和DUOXA2基因表達分別上、下調(diào)的結(jié)果說明,低鈣環(huán)境下培養(yǎng)可能會影響細(xì)胞甲狀腺素的合成,致使甲狀腺素含量異常,影響骨的代謝過程[25],進而影響鈣水平的調(diào)節(jié)。因此,KAT2A和DUOXA2基因差異表達可能間接與該細(xì)胞應(yīng)對低鈣培養(yǎng)環(huán)境有關(guān),這為尋找圍產(chǎn)期奶牛低鈣血癥生物標(biāo)志物提供了研究方向,但其具體參與機制和臨床應(yīng)用還需進一步的研究。