沙門菌和大腸桿菌噬菌體對試驗感染小鼠的保護作用

徐鳳宇，朱振宇，蔣依倩，張喜慶，馬紅霞，高云航，么乃全

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118 ；2. 動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林 長春 130118)

沙門菌、大腸桿菌是引起動物敗血癥和腸炎等疾病的重要病原，間或引起食物中毒[1-2]，可在不同動物間傳播[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展及抗生素的不合理使用，耐藥菌株不斷被分離并呈蔓延趨勢[4]，使細菌病的防治愈發(fā)困難，探尋治療耐藥菌感染的新型安全有效抗菌劑成為基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究的結(jié)合點。以細菌為天然宿主的噬菌體具有很好的殺菌能力，并能特異性殺死宿主菌而不破壞正常菌群，成為治療多重耐藥菌感染的新希望[5-7]。

本試驗應(yīng)用前期分離的多重耐藥沙門菌噬菌體SP3383和大腸桿菌噬菌體EP-SY[8-9]，分別進行預(yù)防和治療宿主菌CVCC3383株或SY株感染小鼠試驗，評價噬菌體對耐藥菌感染的防治效果，為更深入探索噬菌體在臨床中的應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株 沙門菌噬菌體SP3383和大腸桿菌噬菌體EP-SY由本實驗室分離并保存。宿主菌豬霍亂沙門菌CVCC3383株，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室老師饋贈，本實驗室保存；大腸桿菌SY株由本實驗室分離并保存。

1.2 主要試劑與儀器 96孔細胞培養(yǎng)板、石蠟，均購自長春華益生物科技有限責(zé)任公司；蘇木素-伊紅染液，購自南京建成生物有限公司；黏附載玻片、蓋玻片，均購自江蘇世泰實驗器材有限公司。酶標儀(15644)為上海京工實業(yè)有限公司生產(chǎn)；手動旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(CUT4062)為德國SLEE醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；倒置顯微鏡(IX71-A21PH)由奧林巴斯中國有限公司生產(chǎn)；生物組織攤烤片機(YT-7FB)為湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司生產(chǎn)。

1.3 實驗動物 2～3周齡、體重10～15 g、健康離乳昆明小鼠110只，購自北京華阜康生物有限公司，預(yù)飼7 d。

1.4 方法

1.4.1 噬菌體體外殺菌活性檢測 制備合適濃度的宿主菌與噬菌體液。取96孔細胞培養(yǎng)板，向各孔中分別加入稀釋的噬菌體液與宿主菌液各100 μL，使其達到最佳感染復(fù)數(shù)(SP3383、EP-SY分別為0.1、0.01)比例，輕微振蕩混勻，置37 ℃下培養(yǎng)；每隔1 h，從左至右依次加入相應(yīng)的100 μL噬菌體液與100 μL宿主菌液，繼續(xù)培養(yǎng)；12 h后用酶標儀測各孔吸光度。對照組為100 μL宿主菌液與100 μL 儲存介質(zhì)(Storage media，SM)液。

1.4.2 噬菌體對細菌感染小鼠的預(yù)防與治療作用

1.4.2.1 噬菌體安全性檢測 (1)無菌檢測：取制備的噬菌體液100 μL，均勻涂布于LB平板上，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，觀察平板上菌落生長情況。(2)噬菌體對小鼠的毒性：將預(yù)飼的健康離乳小鼠30只隨機平分為3組，雌雄各半。第1組小鼠腹腔注射劑量為1012PFU/只的EP-SY噬菌體液；第2組小鼠注射同量的SP3383噬菌體液；第3組小鼠注射生理鹽水。3個組小鼠同條件飼養(yǎng)，觀察記錄臨床表現(xiàn)，7 d后撲殺剖檢，檢查各器官病變。

1.4.2.2 試驗分組 將健康離乳昆明小鼠80只隨機平分為8組。按姚營等[10]方法，在小鼠飲水中加入鏈霉素(5 mg/mL)預(yù)處理1 d，正常飼養(yǎng)1 d，禁食6 h后灌胃接種。感染組小鼠僅灌服接種2×1012CFU/只宿主菌液；預(yù)防組小鼠先灌服2×1011PFU/只 SP3383液或2×1010PFU/只EP-SY液，2 h 后再分別灌服2×1012CFU/只相應(yīng)宿主菌液；治療組小鼠先灌服宿主菌液，2 h后再灌服噬菌體液；對照組灌服滅菌生理鹽水。

1.4.2.3 腸道組織病理切片的制作與觀察 灌胃接種48 h后，將小鼠脫頸，觀察各組小鼠十二指腸、空腸、腸系膜淋巴結(jié)病變，置于10%甲醛中固定，制作石蠟切片并進行H.E.染色，顯微鏡下觀察各組小鼠的病理組織學(xué)變化。

1.4.2.4 脾臟和腸道組織活菌計數(shù) 無菌操作取1.4.2.3中處死小鼠的脾臟和腸道組織(大腸桿菌試驗組取十二指腸，沙門菌試驗組取空腸)，加入等量生理鹽水研磨成勻漿。對勻漿液作10倍梯度稀釋，取適宜稀釋度100 μL涂布于含有Amp和Kan的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基或SS瓊脂培養(yǎng)基表面，干燥，置37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h計數(shù)菌落。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體體外殺菌活性 以時間為橫坐標，以O(shè)D680為縱坐標，繪制噬菌體殺菌活性曲線(圖1)。在初始7 h內(nèi)，在噬菌體SP3383作用下，CVCC3383的濁度逐漸降低，此后，盡管細菌濁度升高，吸光度仍較未處理組低0.3以上；在初始5 h內(nèi)EP-SY殺菌組吸光度基本保持不變且較低，SY株的吸光度隨時間延長呈持續(xù)上升趨勢；5 h后EP-SY組濁度慢慢升高，但較SY組仍低約0.3。說明噬菌體SP3383、EP-SY在共培養(yǎng)前期對宿主菌具一定殺滅作用。

圖1 噬菌體SP3383、EP-SY殺菌活性Fig.1 Bactericidal activity of phage SP3383 and EP-SY

2.2 噬菌體安全性檢測 將涂有SP3383或EP-SY噬菌體液的平板培養(yǎng)24 h后，均未見菌落生長，說明噬菌體液無雜菌污染。小鼠腹腔注射EP-SY或SP3383噬菌體液7 d內(nèi)，生長狀況良好，未出現(xiàn)精神不振、食欲減退、糞便異常等現(xiàn)象，剖檢未見組織器官出現(xiàn)病理變化，說明噬菌體EP-SY、SP3383對實驗小鼠安全。

2.3 腸道組織病理學(xué)檢測 沙門菌感染組小鼠肉眼可見空腸腫脹、出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大、充血，其余各組無明顯病變。顯微鏡下觀察病理切片可見感染組小鼠空腸絨毛刷狀緣部分破裂，杯狀細胞增多(封三彩版圖2A)，預(yù)防組、治療組小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)正常，絨毛刷狀緣完整，與對照組基本一致(封三彩版圖2B～2D)。

圖2 光學(xué)顯微鏡觀察小鼠空腸組織學(xué)變化 (H.E.染色，200×)Fig.2 Histological changes of jejunum in mice observed by light microscope (H.E.staining,200 ×)A：感染組； B：預(yù)防組； C：治療組； D：對照組A:Infection group; B:Prevention group; C:Treatment group; D:Control group

圖3 光學(xué)顯微鏡觀察小鼠十二指腸組織學(xué)變化 (H.E.染色，200×)Fig.3 Histological changes of duodenum in mice observed by light microscope (H.E.staining,200×)A：感染組； B：預(yù)防組； C：治療組； D：對照組A:Infection group; B:Prevention group; C:Treatment group; D:Control group

大腸桿菌感染組小鼠肉眼可見十二指腸腸壁變薄、充滿氣體，腸系膜淋巴結(jié)腫大，其余各組無明顯病變。鏡下可見小鼠十二指腸絨毛部分斷裂，固有層與腸上皮細胞分離(封三彩版圖3A)，預(yù)防組、治療組小鼠腸絨毛排列整齊，與對照組相近(封三彩版圖3B～3D)。

2.4 脾臟和腸道組織活菌計數(shù) 沙門菌組灌胃接種48 h后，取小鼠脾臟和空腸，用SS瓊脂培養(yǎng)基活菌計數(shù)。結(jié)果如圖4所示，對照組脾臟及空腸勻漿中幾乎無宿主菌生長；預(yù)防組(6.2×102CFU/g，4.2×104CFU/g)、治療組(3.9×102CFU/g，1.2×105CFU/g)的脾臟及空腸勻漿中宿主菌數(shù)量較感染組(2.4×104CFU/g，6.7×107CFU/g)低，且差異顯著(P<0.05)。說明噬菌體SP3383對耐藥沙門菌CVCC3383株引起的小鼠感染有一定預(yù)防和治療作用。

圖4 小鼠脾臟和空腸的沙門菌CVCC3383株活菌計數(shù)結(jié)果Fig.4 Counting results of Salmonella CVCC3383 strain of mice spleens and intestine 注：與感染組比較，*：P<0.05；下圖同Note: Compare to infection group,*：P<0.05. The same as below

大腸桿菌組灌胃接種48 h后，取小鼠脾臟和十二指腸，用含有Amp和Kan的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基活菌計數(shù)。結(jié)果如圖5所示，對照組脾臟及十二指腸勻漿中幾乎無宿主菌生長，預(yù)防組(1.7×102CFU/g，2.4×105CFU/g)、治療組(4.2×102CFU/g，3.8×105CFU/g)脾臟及十二指腸勻漿中宿主菌數(shù)量明顯低于感染組(1.8×104CFU/g，1.9×108CFU/g)，且差異顯著(P<0.05)。說明噬菌體EP-SY對耐藥性SY株大腸桿菌引起的小鼠感染有預(yù)防和治療作用。

3 討論

體外殺菌活性試驗發(fā)現(xiàn)，噬菌體SP3383和EP-SY分別在與宿主菌作用初始的7 h和5 h內(nèi)可使宿主菌數(shù)量明顯減少，之后上升；羅薇的研究[11]也表明，沙門菌與其噬菌體共培養(yǎng)4 h內(nèi)宿主菌的OD值呈下降趨勢，4 h后略上升；這種現(xiàn)象可能與細菌針對噬菌體感染產(chǎn)生的抗性有關(guān)[12-13]，宿主菌可能通過阻止吸附、抑制DNA注入、阻斷DNA復(fù)制、群體感應(yīng)系統(tǒng)、流產(chǎn)感染等方式抵抗噬菌體，如普遍存在于細菌中的CRISPR-Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含規(guī)律成簇的間隔性短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和與其相關(guān)的Cas基因[14]，宿主菌受到噬菌體感染時，會在CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)插入一段與噬菌體序列一致的間隔序列，應(yīng)用這一序列合成并加工成小的CRISPR RNA(crRNAs)，誘導(dǎo)細菌降解噬菌體核酸[15-16]。本研究應(yīng)用的宿主菌以哪種方式抵抗噬菌體值得深入探究。

噬菌體治療效果與其給藥途徑密切相關(guān)[17]，目前最常見的給藥途徑是腹腔注射和口服。其中注射給藥主要針對引發(fā)菌血癥及敗血癥的病原菌感染，治療胃腸道細菌感染多采用口服方式。進入腸道的噬菌體不僅可在腸腔內(nèi)定殖，還可通過腸黏膜移位至局部淋巴結(jié)及內(nèi)臟[18]。本研究采用口服噬菌體途徑預(yù)防和治療大腸桿菌病和沙門菌感染，發(fā)現(xiàn)噬菌體能明顯緩解大腸桿菌或沙門菌對小鼠腸道的損傷，顯著降低脾臟及腸道中宿主菌的數(shù)量，但未能完全阻止菌血癥的發(fā)生，雖然在實踐中使動物體內(nèi)病原菌數(shù)量控制在最小致死量以下，可以大大減少損失，但如果能采用多株噬菌體同時應(yīng)用的雞尾酒療法或與其他益生微生物或內(nèi)酯酶[19]、藥物等聯(lián)用，會使其發(fā)揮更高的治療價值。