CRABP1 過表達載體的構(gòu)建及其對豬卵泡顆粒細胞凋亡的影響

吳夏夢，劉進輝，王 英，雷 磊，周展波，王水蓮*，張虹亮*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128；2.長沙市雨花區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖南長沙 410014）

維甲酸（Retinoic Acid，RA）又稱視黃酸，是體內(nèi)存在的具有生物活性的維生素A 衍生物[1]。視黃酸在體內(nèi)具有生物活性的代謝產(chǎn)物主要包括全反式視黃酸（All-trans Retinoic Acid，ATRA）、9-順式視黃酸（9-cis retinoic acid，9-cis-RA）和13-順式視黃酸（13-cis Retinoic Acid，13cRA）3 種[2]。視黃酸具有廣泛的生物學功能，可參與調(diào)節(jié)細胞增殖生長、誘導細胞分化和凋亡及抑制惡性腫瘤細胞生成等[3-4]。視黃酸結(jié)合蛋白1（Cellular Retinoic Acid-Binding Protein1，CRABP1）是一種高度保守的細胞體蛋白[5]，是細胞液中視黃酸分子與細胞核上視黃酸核受體互相作用的重要物質(zhì)[6]，其表達非常廣泛，幾乎存在于各種組織細胞中。CRABP1基因在各種生物過程中都起著至關重要的作用[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，CRABP1 可參與胚胎小鼠心臟發(fā)育和小鼠脂肪前體細胞的分化調(diào)控[8-9]，在食蟹獼猴胚胎干細胞向神經(jīng)干細胞分化的過程中CRABP1基因表達增加[10]。這些研究表明CRABP1 可能影響胚胎發(fā)育和細胞分化。CARBP1 主要功能是在胞漿中結(jié)合RA，限制其進入細胞核，在微粒體P450 氧化酶的作用下RA 可被氫化為水溶性無活性產(chǎn)物而喪失功能[11-12]。CRABP1 在RA 介導的細胞分化和增殖過程中起著重要的作用，被認為是RA 信號的重要調(diào)節(jié)因子[13-14]。但CRABP1 是否介導了ATRA 影響豬卵泡顆粒細胞凋亡尚不清楚。本研究旨在構(gòu)建豬CRABP1 真核表達載體，并將其轉(zhuǎn)染到豬卵泡顆粒細胞中，進一步研究CRABP1 能否介導ATRA 對豬卵泡顆粒細胞凋亡的影響，為研究CRABP1 在卵泡發(fā)育過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 豬卵巢來自湖南紅星盛業(yè)食品股份有限公司。ATRA 購自Sigma 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶、pGEM-T 質(zhì)粒載體購于Promega 公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購自OMEGA公司；DH5α 感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000 購自Invitrogen 公司；Opti-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco 公司；DMEM/F12（1X）培養(yǎng)基購自HyClone。

1.2 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank 發(fā)布的相關編碼區(qū)序列，利用Primer Premier 5.0 設計引物，送往華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 目的基因的擴增 用傳統(tǒng)Trizol 法提取豬卵巢RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進行目的基因擴增。

1.4 CRABP1 過表達載體的構(gòu)建 本實驗所用的真核表達載體為pcDNA3.1（+），載體圖譜如圖1 所示。

圖1 pcDNA3.1（+）質(zhì)粒圖譜

根據(jù)NCBI 上GenBank 中公布的豬CRABP1mRNA全長序列，設計含有酶切位點引物。上游引物：5'-AAG CTTATGCCCAACTTCGCAGG-3'；下游引物：5'-GAA TTCTCACTCCCGAACATAAATTCT-3'，下劃線指的是HindIII、EcoRI 的酶切位點。

以豬卵巢組織cDNA 為模板，通過設計含酶切位點引物進行PCR 擴增，膠回收產(chǎn)物與pGEM-T 載體4℃連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐西林的LB 固體培養(yǎng)基中，37℃正置1 h 后倒置培養(yǎng)過夜。次日，隨機挑選單克隆菌落于具有氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12～14 h，大量擴增并小提質(zhì)粒。分別將上述含目的基因質(zhì)粒（pGEM-T-CRABP1）和pcDNA3.1 載體應用相對應的限制性內(nèi)切酶37℃酶切1 h。電泳后，膠回收酶切產(chǎn)物，利用T4 連接酶將目的片段回收產(chǎn)物與酶切后pcDNA3.1 載體回收產(chǎn)物4℃連接過夜。經(jīng)轉(zhuǎn)化、小提質(zhì)粒、保菌、酶切及測序，確定過表達載體是否構(gòu)建成功。按照無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書進行質(zhì)粒大提，并測定其濃度，-20℃保存。

1.5 豬卵泡顆粒細胞的分離培養(yǎng) 從屠宰場取卵巢，放入事先預熱含1% 雙抗生理鹽水中，2～4 h 內(nèi)運回試驗室，用含1%青鏈霉素預熱的生理鹽水沖洗干凈。抽吸卵巢上3～6 mm 的卵泡，將卵泡液37℃沉降15 min 后，取上清液1 000 r/min 離心7 min，棄上清，管底沉淀用紅細胞裂解液37℃處理2 min，1 000 r/min 離心7 min，PBS 洗滌2 遍。將洗滌好的顆粒細胞移入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞成熟培養(yǎng)3 d 后，更換新鮮培養(yǎng)基直到細胞長滿，胰酶消化轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

1.6 豬卵泡顆粒細胞轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達載體qRT-PCR檢測相關基因表達 細胞轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine TM2 000 說明書進行。對于基因過表達實驗，要求轉(zhuǎn)染時細胞密度達到70%～80%匯合；單獨轉(zhuǎn)染處理24 h以及轉(zhuǎn)染后添加1 nmol/L ATRA 的豬卵泡顆粒細胞收樣提取RNA 進行反轉(zhuǎn)錄；qRT-PCR 檢測CRABP1基因的表達及凋亡相關基因XIAP、Bax、Caspase-3、Fas的表達。

qRT-PCR 反應：用ddH2O 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒進行qRTPCR 反應，根據(jù)CT 值采用2-△△Ct法，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的基因的相對表達量。20 μL 反應體系：TB Green 10 μL，上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），ROS 0.4 μL，cDNA 模版2 μL，加RNase free water 至20 μL。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)；熔解曲線：95℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，95 ℃終延伸15 s。qRTPCR 反應引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 反應引物序列

1.7 統(tǒng)計分析 所有實驗都獨立重復至少3 次以上。兩組之間的差異顯著性比較用獨立樣本t 檢驗進行分析，3 組以上的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA）方法進行檢驗。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析都使用SPSS 19.0 軟件程序進行分析，0.01＜P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1CRABP1基因的擴增與鑒定 以豬卵巢組織cDNA為模板，使用上述引物擴增出卵巢CRABP1目的基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2 所示。擴增片段大小約414 bp，與預計片段長度相符，膠回收測序結(jié)果與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中豬CRABP1mRNA 比對同源性為99%（圖3）。結(jié)果表明，CRABP1是高表達于豬卵巢中。

圖2 豬卵巢組織CRABP1 基因 PCR 產(chǎn)物的鑒定

圖3 CRABP1 基因PCR 擴增產(chǎn)物測序比對結(jié)果

2.2 重組表達載體的PCR 鑒定與雙酶切鑒定 利用限制性內(nèi)切酶對陽性克隆質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定分別顯示大小約414 bp 的CRABP1條帶和5 428 bp 的pcDNA3.1（+）質(zhì)粒條帶（圖4），其結(jié)果與預期相符。

圖4 重組表達載體雙酶切檢測圖

2.3 重組表達載體的測序鑒定 將重組表達載體送至華大基因進行測序鑒定，結(jié)果證明CRABP1基因已正確地插入到載體中（圖5），測序結(jié)果與預期相符。

圖5 CRABP1 過表達載體酶切測序結(jié)果圖

2.4 轉(zhuǎn)基因細胞qRT-PCR 檢測

2.4.1 CRABP1 過表達影響豬卵泡顆粒細胞凋亡 如圖6 顯示，CRABP1 轉(zhuǎn)染豬顆粒細胞24 h 后，過表達CRABP1 組CRABP1表達與pcDNA3.1 空載體組相比極顯著升高；抗凋亡基因XIAP[15]與pcDNA3.1空載體組相比無顯著性變化；促凋亡相關基因Bax、Caspase-3、Fas[16]與pcDNA3.1 空載體組相比極顯著升高，表明CRABP1 過表達對豬顆粒細胞的凋亡有促作用。

圖6 CRABP1 過表達對豬卵泡顆粒細胞凋亡的影響

2.4.2 CRABP1 介導ATRA 調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡 圖7 表明，pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加DMSO 組與pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組相比，CRABP1的表達變化不顯著；CRABP1 過表達載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組CRABP1的表達極顯著高于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組。進一步研究顯示，與pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組相比，pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加DMSO 組抗凋亡基因XIAP變化不顯著，而pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加ATRA 組促凋亡基 因Bax、Caspase-3、Fas則顯著低于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染后添加DMSO 組；通過先轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達載體再添加ATRA 后，抗凋亡基因XIAP與促凋亡基因Bax、Caspase-3、Fas的表達均顯著高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 空載體再添加ATRA 細胞組。

圖7 CRABP1 介導ATRA 調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡

3 討 論

細胞視黃酸結(jié)合蛋白（CRABP）屬于細胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白（ILBP）的多基因家族，有2 種高濃度的同源蛋白，分別是CRABP1 和CRABP2，參與視黃酸的轉(zhuǎn)運和代謝等功能[8,17-18]。相關報道表明，在食管鱗狀細胞癌細胞中CRABP1缺失可促進細胞生長[19]。CRABP1 通過激活非典型的ERK1/2 凋亡通路誘導癌細胞死亡[20]。但CRABP1是否參與豬卵泡顆粒細胞凋亡的調(diào)控尚無相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達CRABP1能調(diào)控豬卵泡顆粒細胞相關凋亡基因的表達進而促進細胞凋亡。

顆粒細胞的凋亡是導致發(fā)育期卵泡發(fā)生閉鎖的關鍵因素[21]。凋亡包括線粒體凋亡途徑和外源性凋亡通路2 個主要通路，2 種通路最終導致半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族激活，引起一系列級聯(lián)反應，致使細胞凋亡。Bax、Caspase-3、Fas 均是細胞凋亡信號通路的關鍵細胞因子，其中Bax 在受到死亡信號的刺激后被激活進而促進細胞凋亡，F(xiàn)as 是一個位于細胞表面誘導細胞凋亡的跨膜蛋白，而Caspase-3 是凋亡的關鍵蛋白酶，一旦被激活，即發(fā)生下游的級聯(lián)反應，引發(fā)凋亡[22-24]。本研究結(jié)果顯示，CRABP1 過表達載體轉(zhuǎn)染顆粒細胞后，其Bax、Caspase-3、FasmRNA 表達量均顯著增加。蔣鵬飛等[25]研究發(fā)現(xiàn)，密蒙花顆粒劑可通過抑制淚腺組織中凋亡因子Bax、Caspase-3、Fas 和FasL 表達從而抑制淚腺細胞凋亡；而張坤[26]研究發(fā)現(xiàn)，過量錳可誘導雞腦組織和雞胚神經(jīng)細胞凋亡基因Bax、Caspase-3mRNA 以及FasmRNA 的表達，抑制抗凋亡基因Bcl-2mRNA 及Bcl-xmRNA 表達，引起細胞凋亡。裴巖巖等[27]實驗發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷處理人乳腺癌MCF-7 細胞后Bax、Caspase-3mRNA 顯著上調(diào)，Bcl-2mRNA 下調(diào)，表明黃芪甲苷可誘導人乳腺癌MCF-7 細胞凋亡。上述研究表明，通過檢測凋亡相關基因表達變化可直接揭示細胞凋亡效應。細胞凋亡蛋白X 染色體連鎖抑制劑（XIAP）可控制細胞在幾種調(diào)節(jié)細胞死亡途徑中的存活，可阻斷Caspase 誘導的細胞凋亡，使細胞逃避凋亡[28-29]。本實驗通過向豬卵泡顆粒細胞轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達載體后，檢測出XIAP的表達與空載體組相比無顯著性變化。以上結(jié)果表明，CRABP1 過表達可通過調(diào)控凋亡相關基因表達進而誘導豬卵泡顆粒細胞凋亡。

此外，有研究表明，CRABP1 能夠通過結(jié)合ATRA后參與ATRA 分解代謝[30]。通過轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達載體至豬卵泡顆粒細胞后發(fā)現(xiàn)其可抵抗ATRA 對細胞Bax、Caspase-3、FasmRNA 表達的抑制作用，這與CRABP1 可介導ATRA 誘導絨山羊毛乳頭細胞凋亡的研究結(jié)果相一致[31]。當轉(zhuǎn)染CRABP1 過表達載體后再添加ATRA 也顯著提高了XIAP在豬卵泡顆粒細胞中的表達，其原因可能與顆粒細胞維持體細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)有關，但具體機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

本實驗成功構(gòu)建豬CRABP1 過表達載體，并確定其對豬卵泡顆粒細胞的促凋亡效應；通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，CRABP1 可介導ATRA 調(diào)控豬卵泡顆粒細胞凋亡，提示CRABP1 可能在豬卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。