抗菌肽Protegrin-1 的研究進(jìn)展

施益如，李 暄，蔡明燴，段玉婉，劉璨穎

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528231）

近年來，抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)，開發(fā)新的抗菌物質(zhì)成為應(yīng)對日益增長的耐藥性病菌的重要途經(jīng)[1]?？咕氖巧矬w內(nèi)產(chǎn)生的小分子活性多肽，是機(jī)體天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽不易使病原微生物產(chǎn)生耐藥性，在機(jī)體抵抗外源病原微生物入侵過程中發(fā)揮重要作用，因此在醫(yī)藥開發(fā)、動植物抗病及治療中具有廣泛的應(yīng)用價值。防御素和Cathelicidin 是哺乳動物抗菌肽中非常重要的兩大家族，Protegrins 是豬源Cathelicidin 家族的重要成員之一[2-3]。Protegrins家族已鑒定出5 個含有16～18 個氨基酸的天然多肽，即PG1 到PG5，Protegrin-1（PG1）因其有效的抗菌活性和體內(nèi)的穩(wěn)定性為人們所關(guān)注[4-5]。PG1 具有廣譜抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌等多種傳播性病原體作用[6]。PG1 制品作為畜禽無抗飼料的添加成分，將有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。本文綜述了PG1 的分子結(jié)構(gòu)、功能作用、表達(dá)調(diào)控因素和在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用，闡述其發(fā)揮生物活性的機(jī)制和潛在的應(yīng)用價值，并對今后PG1的研究方向進(jìn)行展望，為生產(chǎn)中抗菌肽PG1 的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 PG1 的分子結(jié)構(gòu)

PG1 的分子量約3.1 ku[8]，包含18 個氨基酸（RGGRL CYCRR RFCVC VGR），還含有高含量的半胱氨酸（Cys）以及帶正電荷的精氨酸（Arg）殘基，Miyasaki 等[9]的X-射線衍射研究實(shí)驗(yàn)表明，PG1 具有2 個分子內(nèi)二硫鍵（Cys6-Cys15 和Cys8-Cys13），C 端酰胺化。PG1 呈“發(fā)夾式”分子構(gòu)型，含有β-轉(zhuǎn)角鏈接而成的雙鏈反平行式β-片層二級結(jié)構(gòu)，中間為疏水區(qū)域，兩端為親水區(qū)域，PG1 可以與細(xì)胞膜上的陰離子發(fā)生交互作用[6]。二硫鍵對PG1β折疊結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定提供了強(qiáng)有力的束縛力，可以有效限制帶正電荷高度親水的精氨酸，β折疊結(jié)構(gòu)中大量的疏水性殘基使PG1 和其他抗菌肽具有相似的兩親性[10]。而抗菌肽在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上有顯著差異，但大多數(shù)是陽離子。它們可以采用兩親性構(gòu)象，容易與細(xì)菌細(xì)胞表面的負(fù)電荷成分相互作用，并整合到脂質(zhì)雙層中[11]。

2 PG1 的基因表達(dá)

2.1 PG1 在體內(nèi)的表達(dá)特性 PG1 的表達(dá)是在骨髓細(xì)胞分化的過程中進(jìn)行，其主要在動物的骨髓干細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞中表達(dá)；在胸腺、肝、淋巴結(jié)等組織中也有表達(dá)，PG1 在豬的肺臟和小腸組織中表達(dá)量相對較低；在成熟的嗜中性細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[12]。除在不同的組織中表達(dá)有差異之外，PG1 在不同品種動物中的表達(dá)也存在一定差異。PG1 在民豬和長白豬的胸腺、脾臟、肝臟和心臟中表達(dá)量較高，而在空腸、回腸、舌和淋巴結(jié)中表達(dá)量較低，且PG1基因在民豬體內(nèi)大部分組織中mRNA 表達(dá)量都高于長白豬[13]。

2.2 影響PG1 表達(dá)量的因素

2.2.1 斷奶及仔豬日齡對PG1 表達(dá)的影響 斷奶可顯著降低仔豬中PG1 的表達(dá)，表達(dá)量下降可能與仔豬免疫系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，斷奶后各免疫組織（如仔豬股骨骨髓）中抗菌肽PG1 的表達(dá)水平顯著下降[14]?？咕腜G1 在仔豬免疫組織中的表達(dá)量隨著仔豬日齡增加而表現(xiàn)出一定規(guī)律，出生時最低，隨著日齡增加其表達(dá)顯著增加，斷奶時顯著下降，隨著斷奶日齡的增加其表達(dá)又呈上升趨勢[14-16]。也有研究表明，PG1 的表達(dá)隨著仔豬體重的增加及免疫系統(tǒng)的完善呈現(xiàn)出一定的生物學(xué)發(fā)育規(guī)律，表達(dá)量先增加后降低[15-16]。

2.2.2 復(fù)合多糖對PG1 表達(dá)的影響 牛膝、玄參、杜仲黃芪、白術(shù)等多種復(fù)合多糖對斷奶仔豬骨髓抗菌肽PG1mRNA 的表達(dá)有明顯促進(jìn)作用，并呈一定劑量效應(yīng)[17-20]。不同劑量的牛膝多糖對斷奶仔豬骨髓PG1mRNA 的表達(dá)均存在不同程度的促進(jìn)作用，并呈非典型的劑量依賴關(guān)系[17]。黃芪多糖肌肉注射于豬體內(nèi)可使PG1 的表達(dá)量升高；黃芪組豬的體內(nèi)PG1 基因表達(dá)水平高于對照組，且黃芪的粒度與作用效果呈負(fù)相關(guān)[18-19]。白術(shù)中含有大量可顯著上調(diào)動物體免疫功能的多糖，PG1基因調(diào)控模塊中存在多糖調(diào)控位點(diǎn)，推測白術(shù)對PG1 的表達(dá)也有調(diào)控作用[20]。

2.2.3 微生物對PG1 表達(dá)量的影響 在外源致病因子的刺激下，機(jī)體內(nèi)PG1 的表達(dá)量會發(fā)生改變，如當(dāng)豬患藍(lán)耳病時，藍(lán)耳病病毒（PRRSV）攻毒會顯著降低PG1 在肺臟中的表達(dá)，而PG1 也會抑制PRRSV 的毒性，因此抗菌肽PG1 可用于藍(lán)耳病治療[15,21]。細(xì)菌（如沙門氏菌）、細(xì)菌分解產(chǎn)物脂多糖（LPS）、細(xì)胞因子白介素（IL-6）和微量養(yǎng)分全反式視黃酸（ATRA）等都能不同程度地促進(jìn)PG1mRNA 的表達(dá)[15-16,22]。在體外骨髓粒細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，LPS 處理后，PG1 的表達(dá)水平顯著上升，與之相似，IL-6 和ATRA 也能誘導(dǎo)PG1基因顯著表達(dá)，其機(jī)制是在編碼PG1的基因啟動子區(qū)有IL-6 等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，而視黃醇（RA）等直接激活PG1 的啟動子[12]。而當(dāng)多黏素B 與LPS 同時存在時，PG1 的表達(dá)受到抑制，其具體機(jī)制尚不明確[12,15]。

2.2.4 其他因素對PG1 表達(dá)量的影響 不同的生理和病理狀況及微量元素等均會影響PG1 的表達(dá)量，因而通過營養(yǎng)調(diào)控增強(qiáng)其表達(dá)的方法具有重要意義[6,15]，如金屬離子鋅和乳鐵蛋白等能不同程度地促進(jìn)PG1mRNA的表達(dá)[22]。在飼糧中補(bǔ)充銅可提高血清溶菌酶濃度，推測銅可能參與斷奶仔豬骨髓抗菌肽PG1基因的表達(dá)調(diào)控，從而產(chǎn)生抗菌效果，增強(qiáng)仔豬的抗病力[6,23]。

3 PG1 的生物活性及相關(guān)機(jī)制

3.1 抗菌活性及相關(guān)機(jī)制 抗菌肽PG1 具有較好的抗細(xì)菌和真菌的活性，能殺死大腸桿菌、綠膿桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、鼠傷寒沙門氏菌、沙眼衣原體和結(jié)核桿菌等多種革蘭氏陰性菌，能殺滅通過性傳播的淋病雙球菌和沙眼衣原體，并且對衣原體的作用具有血清型依賴性，相比于抗生素的優(yōu)勢在于不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[8,24-25]。PG1 對典型革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的最低抑菌濃度為0.12～2 mg/L，低濃度時可明顯抑制大腸桿菌和枯草芽孢桿菌[26]。PG1 在低離子強(qiáng)度（0.01 mol/L）緩沖液（pH 7.4）中對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌具有殺菌能力，并且對大腸桿菌的殺微生物活性不受生理濃度的氯化鈣和氯化鎂的影響[26]?？咕腜G1 展現(xiàn)了作為抗微生物制劑用于治療由臨床相關(guān)病原體引起的局部或全身性感染的潛力[25]。

抗菌肽（包括PG1）可以選擇性地破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，隔離微生物營養(yǎng)物質(zhì)或者充當(dāng)微生物附著的誘餌來殺滅微生物，同時幾乎不使微生物產(chǎn)生抗性[27]。PGs 的抗菌活性也與其對微生物膜的擾亂有關(guān)。PG1 帶有很強(qiáng)的正電荷，可通過靜電吸附作用吸附于帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，與細(xì)胞膜上的陰離子發(fā)生交互作用形成孔道并發(fā)生二聚化，形成多聚的二聚體大量聚集，最后形成八聚體跨膜孔道，造成不可控的鉀離子和其他分子滲出，隨后細(xì)胞破裂從而發(fā)揮抗菌作用[10]。Knyght 等[28]在Langmuir 膜平衡和中子反射率研究中得出結(jié)論，恒河猴θ-防御素1（RTD-1）和豬PG1 在與陰離子脂質(zhì)單分子膜的相互作用中存在顯著差異，兩親性更強(qiáng)的PG1 完全嵌入到脂質(zhì)膜中，而RTD-1 則以相對較淺的方式相互作用。研究者發(fā)現(xiàn)，PG1 可以通過形成陰離子通道而改變爪蟾母細(xì)胞膜的通透性[29]。

PG1 的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和抗微生物活性與其成孔能力有關(guān)，并依賴于其在β-片層中的折疊，其中β-片層的存在是PG1 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵。PG1 線性化產(chǎn)生的肽載體能夠與細(xì)胞膜相互作用，但沒有分裂膜的活性[30]。PG1在水和二甲亞砜溶液中的核磁共振溶液結(jié)構(gòu)均為單體結(jié)構(gòu)，在模擬膜環(huán)境中的2 個單體C 端在β片之間以氫鍵連接成的二聚體之間的相互連接與孔道的形成有關(guān)。高電荷PG1 本身具有誘導(dǎo)分子電穿孔的能力，只要PG1的電荷足夠大，在PG1 插入膜中后，就能夠首先誘導(dǎo)磷脂雙層膜的水柱或孔形成[31]。而精氨酸殘基是PG1在膜表面結(jié)合的關(guān)鍵，它通過一系列的二齒鍵網(wǎng)絡(luò)與脂膜上的磷原子相互作用有利于PG1 的轉(zhuǎn)運(yùn)[32]。

3.2 抗病毒活性 PG1 對野生型HIV-1 有特異性抑制作用，具有抗人類HIV-1 病毒的活性，它為攻克人類頑疾——艾滋病提供了新的解決途徑[33]。PG1 可明顯抑制HIV 復(fù)制周期的早期，與人Cathelicidin 家族抗菌肽 LL-37 的抗HIV 活性相當(dāng)，兩者還可特異性地抑制慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體活性，但不抑制腺病毒載體的感染性[34]。而在非洲爪蟾皮膚提取的陽離子抗菌肽Magainin-2 及合成肽Modelin1 和Moderln-5 對皰疹病毒HSV-1、HSV-2 有一定的抑制效果，這些抗菌肽不是通過抑制病毒DNA 的復(fù)制或基因表達(dá)起作用，而是直接作用于病毒被膜[29]。

此外，PG1 可抑制登革熱NS2B-NS3 絲氨酸蛋白酶和在MK2 細(xì)胞中的病毒復(fù)制，從而減少病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制，消除登革熱病毒的毒性[35]，也對豬繁殖與呼吸綜合征病毒有很好的抗病毒效果。PG1 的抗病毒作用發(fā)生在HP-PRRSV 吸附宿主細(xì)胞過程中，為通過藥物治療增強(qiáng)對豬繁殖與呼吸綜合征病毒進(jìn)行防控提供有力支持[36]。PG1 在對經(jīng)濟(jì)動物的病毒感染治療中也表現(xiàn)出了應(yīng)用潛力，其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒在Marc-145 細(xì)胞中的感染和復(fù)制有明顯的抑制作用，且在體外對Marc-145 細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性[36]。

3.3 免疫調(diào)節(jié)作用 PG1 及其類似物具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可與多種細(xì)菌內(nèi)毒素和帶負(fù)電的莢膜多糖形成復(fù)合物，從而抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，其中維持免疫調(diào)節(jié)作用活性的先決條件是至少有一個用二硫鍵橋梁穩(wěn)定的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)[37]。PG1 誘導(dǎo)人肥大細(xì)胞脫顆粒，從而促使肥大細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[38]。成熟的PG1 具有促進(jìn)腸細(xì)胞遷移和免疫調(diào)節(jié)作用，從而具有組織修復(fù)能力，推測PG1 可能對胃腸道炎癥性腸綜合征有治療潛力[39]。PG1 及其類似物還可以上調(diào)巨噬細(xì)胞的特異性吞噬反應(yīng)，促進(jìn)T 細(xì)胞增殖啟動特異性免疫。PG1 與LPS 結(jié)合抑制了LPS 的生物活性并阻止其激活TLR4，從而抑制細(xì)胞因子TNE-α和IL-1β從巨噬細(xì)胞釋放。PG1 類似物可中和腦膜炎球菌莢膜多糖聚合物的活性，并抑制IL-1β的釋放。PG1 的“線性化”不能抑制TNE-α或IL-1β的釋放從而顯著降低了其對腦膜炎球菌脂寡糖（LOS）和腦膜炎球菌多糖（CPS）的免疫調(diào)節(jié)活性[37,40]。除了先天免疫細(xì)胞，PG1 通過受體MRGX2 或FPRL1 還可激活肥大細(xì)胞，使其脫粒并抑制細(xì)菌生長，因此PG1 不僅具有抗菌潛力，還通過激活肥大細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，且通過肥大細(xì)胞協(xié)調(diào)適應(yīng)性免疫在傷口愈合中起重要作用[38]。

3.4 細(xì)胞毒性 PG1 對不同類型哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞毒性不一樣，細(xì)胞膜表面的陰離子電荷大小和PG1 與細(xì)胞相互作用時發(fā)生的構(gòu)象變化都會影響細(xì)胞毒性水平。抑制細(xì)胞表面陰離子硫酸化蛋白多糖的合成可以減少PG1 引起的細(xì)胞毒性損傷[41]。PG1 對視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的影響最大，PG1 還會對人成纖維細(xì)胞有毒性，并引起紅細(xì)胞明顯溶解[41]。但利用計算方法評估PG1-5，基于Toxinpred 網(wǎng)站SVM 方法測評顯示PG1無毒性，且PG1 在膜互作位點(diǎn)有芳香族氨基酸殘基因而有較好的細(xì)菌膜通透性[5]，此外，PG1 氨基酸殘基ARG（1）-GLY（17）中存在額外的鍵，其在二級結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性[5]。有研究表明，用組氨酸殘基取代賴氨酸殘基可以降低含組氨酸肽的細(xì)胞毒性，并且保持大多數(shù)多肽的抗菌活性[42]。因此，可以在PG1 的序列基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，研制出有治療價值的小分子多肽。

4 PG1 的應(yīng)用研究

4.1 開發(fā)新型抗菌、抗病毒藥物及應(yīng)用 有研究者采用“分子拼接”的設(shè)計方法，運(yùn)用生物信息學(xué)分析及圓二色譜法分析，雜合設(shè)計得到2 個具有β折疊結(jié)構(gòu)的改良抗菌肽LB-PG 和CA-PG，雜合的改良肽通過與細(xì)胞膜作用和結(jié)合胞內(nèi)DNA 共同作用發(fā)揮作用機(jī)制，能較好地保持PG1 的抗菌活性并擴(kuò)大其抗菌譜，同時顯著降低其對細(xì)胞的毒性，雜合肽的設(shè)計為研究新型抗菌肽提供了新的思路和方法[43]。PG1 作為5 種PG 的支架材料在穩(wěn)定性和無毒性方面具有優(yōu)勢，可以作為未來設(shè)計治療性PG 類似物的潛在支架[5]。而特定序列的PG1 抗菌肽衍生物能夠特異性殺滅各種口腔致病菌，可預(yù)防和治療口腔疾病，治療效果更佳，并且制備的制劑具有穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，有良好的應(yīng)用前景[44]。此外，口服重組PG1 可以減輕葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎引起的體重顯著下降，將來開發(fā)重組PG1 的口服制劑治療腸道損傷和炎癥有很好的前景[45]。

聯(lián)合使用抗菌藥物，特別是具有不同靶點(diǎn)的抗菌藥物，是克服多重耐藥性的已知策略[46]，聯(lián)合應(yīng)用可以減少劑量及副作用。有研究者認(rèn)為，個體抗菌劑在體內(nèi)的高效性可能是生物體內(nèi)抗菌肽的協(xié)同作用引起的[47]。有報道稱抗菌藥物在牡蠣、大黃蜂、甲蟲等群體中有協(xié)同效應(yīng)[48]。PG1 分別與人LL-37、牛bactenecin 和indolicidin 聯(lián)用，對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、糞腸球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的協(xié)同作用效果顯著[49]。Morroni 等[50]檢測PG1 對手術(shù)傷口感染鮑曼桿菌的抗菌和抗生物膜活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PG1 和大腸桿菌素能協(xié)同對抗大腸桿菌素耐藥菌株。PG1 與丁胺卡那霉素、四環(huán)素及多黏菌素B 等聯(lián)用具有不同程度的協(xié)同效應(yīng)，表現(xiàn)出聯(lián)合抗菌作用，但并非與所有抗生素之間都存在協(xié)同關(guān)系，PG1 與先鋒VI、左氟沙星及諾氟沙星之間則表現(xiàn)為不相關(guān)?？咕呐c抗生素之間的相互關(guān)系及具體機(jī)制尚未明確[8,51]。

4.2 在動物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用 目前抗菌肽應(yīng)用廣泛，但天然資源有限，人工化學(xué)合成價格昂貴，隨著基因工程的發(fā)展，將PG1基因?qū)雱游矬w內(nèi)，提高動物的抗病力，是一種較為經(jīng)濟(jì)的方法。有研究表明，PG1在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)增強(qiáng)了小鼠對實(shí)驗(yàn)性細(xì)菌感染的抵抗力，為在中性粒細(xì)胞以外的其他體細(xì)胞組織中表達(dá)PG1 的轉(zhuǎn)基因豬提供了理論依據(jù)[52]。異位表達(dá)PG1的轉(zhuǎn)基因小鼠對豬放線桿菌感染的敏感性較同窩的野生型小鼠更高，且轉(zhuǎn)基因小鼠存活率更高，所以PG1 在小鼠體內(nèi)的異位表達(dá)能增強(qiáng)其對細(xì)菌感染的抵抗力[52]。

在基因工程方面最常用的是利用大腸桿菌工程菌表達(dá)外源蛋白。在大腸桿菌中轉(zhuǎn)入PG1 的成熟肽基因，構(gòu)建可表達(dá)融合蛋白的GST-PG1 基因工程菌，該重組菌具有顯著的抗菌效果[53]。還可將編碼成熟PG1 的DNA 序列與6His 標(biāo)簽融合，克隆到pPICZα-A 載體中，再轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中，表達(dá)的PG1/6His 對HepG2 細(xì)胞具有強(qiáng)烈的劑量和時間依賴性、抗癌活性[54]。這些研究為開發(fā)抗菌肽PG1 制劑提供了基礎(chǔ)材料。

4.3 在免疫調(diào)節(jié)中的潛在應(yīng)用研究 PG1 的抗菌特性已經(jīng)得到了很好證實(shí)，但是其在免疫調(diào)節(jié)中的作用研究還有待完善。有研究者探索PG1 在免疫調(diào)節(jié)中的替代作用和潛在機(jī)制，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成熟PG1 促進(jìn)腸細(xì)胞遷移的過程，與PG1 對細(xì)胞遷移相關(guān)基因的表達(dá)改變有關(guān)，還促進(jìn)了免疫相關(guān)因子和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[45]。進(jìn)一步的研究表明，成熟PG1 能刺激IGF1R，并通過該受體調(diào)節(jié)免疫活性和細(xì)胞遷移，因此PG1 可能對胃腸道炎癥有一定治療潛力，同時推測PG1 在免疫調(diào)節(jié)中的應(yīng)用也有一定可突破性。

5 小結(jié)和展望

基于近年來抗生素在養(yǎng)殖及藥物產(chǎn)業(yè)限制使用，研究健康、無害、高效、綠色飼料添加劑產(chǎn)品成為當(dāng)前畜牧獸醫(yī)行業(yè)的熱點(diǎn)?？咕腜G1 具有有效的抗病原微生物活性、免疫調(diào)節(jié)作用，能提高動物對疾病的抵抗能力，促進(jìn)動物生長性能，且不易使動物產(chǎn)生耐受性，此外PG1 能通過基因工程大量表達(dá)，在體內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。目前，抗菌肽PG1 及其結(jié)構(gòu)類似物的作用機(jī)制也得到了深入研究，為開發(fā)出穩(wěn)定性更好、活性更強(qiáng)、毒性更低的抗菌肽藥物奠定了基礎(chǔ)，PG1 及其類似物的開發(fā)將在動物養(yǎng)殖及治療行業(yè)中具有重要的潛力和意義。