GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢公豬的糞便Ca、P含量差異及機制研究

王彥旭，韓興發(fā)，曾憲垠，曹曉涵，孟風艷

（四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川雅安 625014）

為去除由睪丸分泌的雄烯酮在脂肪沉積所導致的肉“膻味”，養(yǎng)豬生產(chǎn)中公豬需先閹割去勢后育肥[1-4]。然而，外科閹割會引起動物高度應(yīng)激、外科傷口感染、死亡等不良后果[1,4]，已越來越不被人們所接受[5-6]。促性腺激素釋放激素（GnRH）主動免疫動物可刺激機體產(chǎn)生大量抗GnRH 抗體，特異性“中和”內(nèi)源性GnRH，從而抑制生殖軸活性，達到去勢的目的[1]。目前，GnRH 主動免疫已成為最有望替代傳統(tǒng)外科閹割的新去勢方法[1-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，GnRH 主動免疫除顯著抑制公豬生殖功能，降低脂肪中雄烯酮含量外，還可顯著降低公豬糞便Ca、P排泄量[7]。然而，目前尚不清楚GnRH 主動免疫去勢是如何降低公豬糞便Ca、P 等礦物元素含量。Ca、P 經(jīng)腸道消化后由小腸黏膜細胞中相應(yīng)Ca、P 轉(zhuǎn)運載體協(xié)助運輸至胞內(nèi)[8-9]，未吸收部分則隨糞便排出體外，進而造成環(huán)境污染。有研究報道，生長激素可通過影響腸道黏膜生長和分化，繼而影響腸道微量元素的吸收[10-11]。據(jù)此，本研究擬對比研究GnRH 主動免疫和手術(shù)去勢對公豬血清生長相關(guān)激素含量、小腸黏膜Ca 和P 轉(zhuǎn)運載體基因表達水平及糞便中Ca、P 含量的影響，以解析GnRH 主動免疫降低公豬糞便Ca、P 含量的分子機制。

1 材料與方法

1.1 疫苗制備 GnRH 疫苗制備參照Oonk 等[12]的方法進行。

1.2 實驗設(shè)計 將30 頭10 周齡公豬（大白×長白×杜洛克）隨機分為3 組，每組10 頭。其中對照組不做任何處理，手術(shù)去勢組公豬在出生1 周內(nèi)進行手術(shù)閹割。免疫去勢組公豬在10 周齡時耳后頸部肌肉注射2 mL 62.5 μg GnRH 肽當量去勢疫苗，并于8 周后以同樣的免疫方式和劑量進行加免[3]。試驗前和試驗期間所有公豬自由采食和飲水，加免后8 周（即26 周齡時）將所有動物進行屠宰取樣。

1.3 樣品采集及屠宰 所有公豬于初免當天及初免后4、8、16 周頸靜脈采血10 mL。為減少因采血時間不同造成血液分析指標差異，每次采血時間均限定在08:00 采食飼料前。所有血樣于4℃條件下，2 000 ×g 離心15 min 后分離血清，并于-20℃冰箱保存，用以血清激素含量的測定。加免后8 周屠宰所有試驗公豬，迅速分離十二指腸，玻片刮取腸黏膜，液氮速凍后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱保存待用。屠宰前1 周起每天早晨收集公豬糞便，連續(xù)收集7 d。糞便收集后，室內(nèi)自然風干后，過0.5 mm 篩，每頭豬每天取0.5 g 風干糞便混合在一起，-20℃保存，用于測定糞便中Ca 及P 含量。

1.4 糞便Ca、P 含量測定 公豬糞便中Ca、P 含量采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）測定。每個糞便樣本重復測量2 次，測量由四川農(nóng)業(yè)大學分析中心完成。

1.5 血清生長激素測定 利用酶聯(lián)免疫法（ELISA）技術(shù)測定公豬血清中生長激素（GH）和胰島素樣生長因子1（IGF1）濃度。測定方法嚴格參照試劑盒（Cusabio Biotech Co.Ltd）的操作說明書進行，每個樣品重復測定2 次。GH 及IGF1 測定靈敏度分別為 2.5 ng/mL及0.156 ng/mL。所測定激素批內(nèi)及批間變異系數(shù)均＜15%。

1.6 基因檢測 用液氮將公豬十二指腸黏膜組織研磨至粉狀，取約100 mg 組織粉末通過苯酚-氯仿法提取組織總RNA。參照試劑盒（Invitrogen Co.，Carlsbad，CA，USA）說明書進行RNA 提取。凝膠電泳檢測RNA 的完整性，然后用Nanodrop 2000 測定總RNA 濃度及純度。取1 μg RNA 用于反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑采用試劑盒PrimeScript?RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa，Dalian，China）。以cDNA 為模板，設(shè)計基因特異性引物（表1），利用熒光定量PCR 方法檢測目的基因的表達，每個樣品重復3 次。PCR 反應(yīng)條件：95℃預變性2 min，95℃變性10 s，57～62℃退火，延伸25 s，反應(yīng)結(jié)束后用熔解檢測PCR 擴增產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因，目的基因mRNA 表達經(jīng)β-actin矯正t 后，采用標準曲線法計算其相對表達量。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計分析 利用SAS 9.2 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。3 組公豬十二指腸黏膜目的基因mRNA 的表達及糞便中Ca、P 含量的差異，采樣GLM 過程進行單因素方差分析，Duncan's 法進行多重比較。GH 和IGF1 含量采用混合模型（Mixed Model）重復性測量（Repeated Statement）方差分析。模型固定因素包括試驗處理、采樣時間及兩者間的交互作用，隨機因素包括各處理組中動物個體。采用Pearson 對血清IGF1 濃度與小腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達水平間進行相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值± 標準差表示，其中P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 糞便中Ca、P 含量 如圖1 所示，與對照公豬相比，公豬手術(shù)去勢糞便中Ca、P 含量均增加（P＜0.05）。GnRH 免疫后公豬糞便Ca、P 含量雖也升高，但仍低于手術(shù)去勢組公豬（P＜0.05）。

圖1 GnRH 主動免疫對公豬糞便Ca、P 含量的影響

2.2 血清生長激素濃度 如圖2 所示，血清GH 和IGF1 濃度受試驗處理、采樣時間及兩者間交互作用的影響（P＜0.0001）。對照公豬中，血清GH 和IGF1 濃度在免疫去勢期間隨青春期發(fā)育而升高（P＜0.05），從加免后到試驗結(jié)束時保持相對穩(wěn)定。手術(shù)去勢組公豬的血清GH 和IGF1 濃度在手術(shù)去勢后顯著降低，整個試驗期間一直低于對照組公豬血清GH 和IGF1 濃度（P＜0.05）。免疫去勢公豬的血清GH 和IGF1 濃度在初免到加免期間與對照組公豬血清GH 和IGF1 無顯著差異，但加免后開始下降，到屠宰取樣時低于對照組（P＜0.05），但仍高于手術(shù)去勢組公豬（P＜0.05）。

圖2 GnRH 主動免疫對血清IGF1 和GH 濃度的影響

2.3 十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達 如圖3 所示，與對照組公豬相比，手術(shù)去勢下調(diào)公豬十二指腸黏膜Ca 離子轉(zhuǎn)運載體TRPV6及PMCA1mRNA表達水平（P＜0.05），下調(diào)公豬十二指腸黏膜P 離子轉(zhuǎn)運載體Npt2bmRNA 表達水平（P＜0.05），而對公豬Ca 離子轉(zhuǎn)運載體CalbindinmRNA 表達無影響。而GnRH 主動免疫對上述所測公豬十二指腸黏膜Ca、P 相關(guān)轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達水平均無顯著影響。

圖3 GnRH 主動免疫對十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達的影響

2.4 血清IGF1 與小腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因mRNA表達相關(guān)分析 Pearson 相關(guān)分析顯示，血清IGF1 濃度與十二指腸Ca 離子轉(zhuǎn)運載體TRPV6（r=0.6807，P＜0.001）、PMCA1（r=0.3399，P=0.0661）、P 離 子轉(zhuǎn)運載體Npt2b（r=0.4396，P＜0.0151）mRNA 表達量存在顯著正相關(guān)（圖4），表明十二指腸Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達受血清IGF1 水平的影響。

圖4 血清IGF1 與十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達相關(guān)性

3 討 論

本團隊前期研究表明，GnRH 主動免疫顯著降低公豬血液生殖激素濃度，顯著抑制睪丸發(fā)育和精子生成；同時相較于手術(shù)去勢公豬，GnRH 主動免疫顯著降低公豬背膘厚度，提高公豬的生產(chǎn)性能，表明GnRH 主動免疫完全可以替代傳統(tǒng)外科去勢應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖[3]。在此基礎(chǔ)，本實驗進一步開展GnRH 主動免疫與手術(shù)去勢對公豬糞便Ca、P 含量的影響，為降低生豬養(yǎng)殖帶來的環(huán)境Ca、P 污染提供參考。

十二指腸是Ca、P 等元素消化吸收的主要場所[13]，其中十二指腸對Ca 的吸收程度主要依賴于Ca 離子載體Calbindin、TRPV6及PMCA1的表達量[8]；對P 的吸收程度主要依賴P 離子轉(zhuǎn)運載體NPT2b 的表達量[9,14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，手術(shù)去勢顯著下調(diào)公豬十二指腸黏膜Ca 離子轉(zhuǎn)運載體TRPV6及PMCA1mRAN 表達水平，顯著下調(diào)小腸黏膜P 離子轉(zhuǎn)運載體NPT2bmRNA 表達水平。與手術(shù)去勢形成鮮明對比，GnRH 免疫去勢對公豬十二指腸黏膜上述Ca、P 離子轉(zhuǎn)運載體基因mRNA 表達均無明顯影響。相應(yīng)地，GnRH免疫去勢公豬糞便Ca、P 含量也顯著低于手術(shù)去勢公豬。因此，相較于手術(shù)去勢公豬，GnRH 免去勢公豬可能因小腸Ca、P 轉(zhuǎn)運載體表達較高，小腸Ca、P 吸收效率也較高，最終糞便Ca、P 環(huán)境排泄量降低。但本研究未對糞便Ca、P 排泄總量進行測定和計算，上述結(jié)論尚需進一步驗證。

哺乳動物胃腸道黏膜是機體更新速度最快的組織[10]，小腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體數(shù)量受黏膜更新影響[8,13]。研究顯示，GH-IGF1 可通過影響小腸黏膜的生長和分化，繼而影響小腸對Ca、P 的吸收[11]。本研究中公豬手術(shù)去勢后血清GH 和IGF1 濃度顯著降低，而GnRH 主動免疫去勢公豬血清GH 和IGF1 濃度雖有所降低但仍顯著高于手術(shù)去勢公豬，與前人研究結(jié)果一致[15-16]。相關(guān)分析顯示，血清IGF1 濃度與十二指腸黏膜Ca、P 轉(zhuǎn)運載體基因表達存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，表明GH-IGF1對公豬小腸黏膜Ca、P 離子轉(zhuǎn)運載體基因表達具有重要調(diào)控作用。因此，GnRH 免去勢公豬小腸黏膜Ca、P轉(zhuǎn)運載體基因表達顯著高于手術(shù)去勢公豬，主要是由于其體內(nèi)GH-IGF1 濃度相對較高所致。同時，大鼠中研究也發(fā)現(xiàn)GH-IGF1 可通過上調(diào)十二指腸Ca、P 離子轉(zhuǎn)運載體基因表達，繼而提高小腸對Ca、P 等微量元素離子的吸收[17]。

4 結(jié) 論

綜上所述，GH-IGF1 是調(diào)控公豬小腸黏膜Ca、P離子轉(zhuǎn)運載體基因表達的重要因子。相較于手術(shù)去勢公豬，GnRH 主動免疫去勢公豬體內(nèi)較高水平的GHIGF1 提高了小腸黏膜Ca、P 離子轉(zhuǎn)運載體基因表達；較高水平的Ca、P 離子轉(zhuǎn)運載體基因表達或許可提高小腸對Ca、P 離子的吸收率，繼而降低糞便Ca、P 含量及Ca、P 環(huán)境排泄量。因此，養(yǎng)豬生產(chǎn)中，可將GnRH主動免疫作為一種降低公豬糞便Ca、P 含量的手段加以推廣應(yīng)用。