鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

劉文靜，凡文磊，劉大鵬，趙金山，周正奎*，侯水生*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

我國是鴨肉生產(chǎn)和消費大國，鴨存欄量和消費量約占全球的75%[1]。北京鴨肌內(nèi)脂肪含量為4%～6%[2]，肉質(zhì)極為鮮嫩。脂肪包含多種脂肪酸，會影響肉的風味、pH、嫩度和多汁性[3]。為探究影響肌內(nèi)脂肪沉積的遺傳機制，Ge 等[4]和徐思雨[5]分別利用巢湖鴨和麻鴨鑒定COMT、NT5E、PDE4D、PLA2G4F、A-FABP和CIDEa、FAS、ATGL基因與肌內(nèi)脂肪相關(guān)。諸多研究報告均表明肌內(nèi)脂肪沉積受基因調(diào)控[4,6]，但影響該性狀的主效基因和遺傳機制仍需進一步挖掘和驗證。

隨著高通量基因分型技術(shù)的發(fā)展，全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）[7]得到更廣泛應(yīng)用，可以更精準定位影響復(fù)雜性狀的基因。Cho等[8]結(jié)合GWAS 和連鎖不平衡分析鑒定出MYH3基因的一段功能性調(diào)控序列變異影響豬肌內(nèi)脂肪積累；其他研究者也在牛[9-10]和雞[11-12]等物種上鑒定出影響肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)基因，如FABP、MC4R、FAS、ELOVL5、FASN和CASP2等。為找到影響鴨胸肌肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)鍵基因，本實驗以北京鴨× 野鴨F2代資源群體為研究材料，測定胸肌肌內(nèi)脂肪含量并進行GWAS 分析，鑒定影響鴨胸肌肌內(nèi)脂肪的相關(guān)基因及其遺傳機制，為改良鴨胸肌肉質(zhì)提供有效的分子標記。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和樣品采集 本研究實驗材料是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平基地種鴨保種場提供。于2015 年以北京鴨（41 只，8 ♂、33 ♀）和綠頭野鴨（28 只，4 ♂、24 ♀）為F0代進行正反交構(gòu)建的F2代資源群體，在相同環(huán)境和飼糧條件下飼養(yǎng)至8 周齡，在相同的環(huán)境條件下進行屠宰。本研究隨機抽取130 只F2代（66 ♂、64 ♀）用于測定其肌內(nèi)脂肪含量。

1.2 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量的測定 本實驗利用索氏提取法[13]測定肌內(nèi)脂肪含量。樣品用真空凍干機[14]獲得肉粉末供后續(xù)檢測。每個樣品稱取3 個對照，105℃烘干4 h。1 份用于檢測肉樣中殘留的水分初始鮮重m2、絕干重m3。剩余2 份平行樣本用于測定肌內(nèi)脂肪含量，初始鮮重為m4，用無水乙醚70℃連續(xù)抽提8 h 烘干后質(zhì)量為m5。實驗用濾紙包相同條件烘干后質(zhì)量為m1。使用差減法測得肌內(nèi)脂肪含量，計算公式：m=m4-（m5+m1）+（m2-m3），其中m 為樣品（絕干）肌內(nèi)脂肪含量。

1.3 遺傳力估計及與性狀相關(guān)性

1.3.1 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪遺傳力估計 本研究利用MTDFREML[15-17]即多性狀非求導(dǎo)約束最大似然法，采用動物模型，確定固定效應(yīng)和隨機效應(yīng)建立混合線性模型，計算胸肌肌內(nèi)脂肪性狀的遺傳力。模型如下：

其中，y為肌內(nèi)脂肪含量表型值；Z為隨機效應(yīng)結(jié)構(gòu)矩陣；a為隨機效應(yīng)向量；X為固定效應(yīng)結(jié)構(gòu)矩陣，其中固定效應(yīng)包括養(yǎng)殖環(huán)境、育種方式、性別；b為固定效應(yīng)向量；e為隨機殘差效應(yīng)向量。

1.3.2 性狀相關(guān)性 利用R 包Hmisc[18]程序計算其他肉質(zhì)性狀（胸肌厚、胸肌重、肉色b*、肌纖維面積和肌纖維直徑[19]）與肌內(nèi)脂肪含量間的皮爾遜相關(guān)及顯著性并用PerFormanceAnalytics 繪制圖形進行數(shù)據(jù)可視化。

1.4 重測序及分析

1.4.1 基因組重測序 動物屠宰前靜脈采血，用酚-氯仿法提取全血DNA[20-21]，使用NanoDrop-2000 和瓊脂糖凝膠電泳對DNA 質(zhì)控后重測序和建庫[20]。每個個體的重測序數(shù)據(jù)量不少于5 Gb。用FAST QC version 0.10.1 軟件對clean reads 進行質(zhì)量控制，后用BWA version 0.7.17 軟件將質(zhì)控后得到的reads 比對到北京鴨參考基因組（GCA_003850225.1）上。用Picard 軟件將重復(fù)比對的reads 移除后用GATK version3.6 軟件的再比對功能，增強插入缺失變異區(qū)域的比對準確性。使用GATK 軟件進行SNP 和插入缺失的鑒定和分析。同時用PLINK 軟件[22]將參數(shù)設(shè)定為最小等位基因頻率MAF＞0.05，個體基因型缺失率＞0.1，以及哈代-溫伯格平衡P＜1×10-6，找出連鎖較強的區(qū)域范圍。

1.4.2 全基因組關(guān)聯(lián)分析及群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 使用EMMAX version beta[23]軟件中的混合線性模型，對肌內(nèi)脂肪含量表型值與全基因組SNP 進行GWAS 分析，同時進行Q-Q plot 檢驗。分析模型為：

其中，y為肌內(nèi)脂肪含量表型值；u為脂肪含量表型值的平均值；X為固定效應(yīng)矩陣，其中固定效應(yīng)包括養(yǎng)殖環(huán)境、育種方式、性別；b為固定效應(yīng)向量；G為F2群體親緣系譜的遺傳矩陣；e是脂肪含量表型值的隨機殘差。

采取BonFerroni 方法確定閾值。利用EIGENSOFT軟件中的SMARTPCA 模塊對該性狀進行主成分（Principal Components Analysis，PCA）分析。

2 結(jié)果

2.1 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪相關(guān)及遺傳力估計 本實驗發(fā)現(xiàn)，鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量在2%～7.5%，平均含量為4.8%且服從正態(tài)分布（圖1）。其中，61%的個體肌內(nèi)脂肪含量在4%～6%，24%的個體肌內(nèi)脂肪含量小于4%，13%的個體肌內(nèi)脂肪含量大于6%。由圖2 可知，2 個主要成分對肌內(nèi)脂肪積累影響效果較明顯，分別貢獻28%和20% 的影響效力。該實驗群體也未出現(xiàn)明顯的群體分層或其他亞群結(jié)構(gòu)，表明群體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。此結(jié)果與后續(xù)分析結(jié)果相結(jié)合，說明本次分析沒有因群體分層而出現(xiàn)假陽性，基于線性模型的全基因組關(guān)聯(lián)分析可靠。

圖1 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量正態(tài)分布

圖2 肌內(nèi)脂肪相關(guān)SNP 的主成分分析

對肌內(nèi)脂肪含量和其他性狀進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)脂肪與b*肉色存在較弱的相關(guān)性（圖3），與胸肌厚和胸肌重的相關(guān)性最強，相關(guān)系數(shù)r分別為0.57 和0.36；與肌纖維面積和直徑也存在較強的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.44 和0.42。使用MTDFREML 軟件中的動物模型進行遺傳力估計，在遺傳方差、環(huán)境方差和表型方差分別為0.103、0.161 和0.264 時，估計肌內(nèi)脂肪含量的遺傳力h2為0.39，具有中等遺傳力。

圖3 肌內(nèi)脂肪與其他性狀相關(guān)性

2.3 脂肪含量的GWAS 結(jié)果分析 將肌內(nèi)脂肪含量的表型數(shù)據(jù)比對到全基因組進行關(guān)聯(lián)分析（圖4），檢測影響肌內(nèi)脂肪含量的遺傳變異相關(guān)的基因位點，共得到7 202 864 個有效SNP 位點，其中有9 個有效SNP達到染色體水平顯著（P＞-log（1/SNP）），與肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)，分別位于1 號染色體、8 號染色體和16 號染色體。這些顯著SNP 一部分坐落于NEGR1、FBRSL1、FPGT、ZRANB2、PTGER3、CTH、ANKRD13C、SRSF11、LRRC40、LRRC7基因。

圖4 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量GWAS 分析曼哈頓圖和QQ-plot

因在1 號染色體和8 號染色體最高點SNP 與基因座的相關(guān)性較強，所以計算最高點SNP 與周圍SNP 之間的成對連鎖不平衡（LD）。根據(jù)相關(guān)性R2值大小將位于1 號染色體的致因變異區(qū)域縮小到4.20～4.38 Mb的0.18 Mb（R2＞0.4）（圖5）。在這個區(qū)域的最高點SNP 處的基因型如圖6 所示（-log10P=6.94）。該點表型均值與基因分型存在等位基因差異，TT 基因型對應(yīng)的肌內(nèi)脂肪平均含量較CC 和CT 基因型更高，推斷隨著等位基因T 的出現(xiàn)表達水平增高，TT 基因型為群體中脂肪代謝的優(yōu)勢基因型。

圖5 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量1 號染色體表型與基因型對應(yīng)的連鎖不平衡分析

圖6 不同染色體關(guān)聯(lián)性最強點的基因分型與表型分布差異

將8 號染色體致因變異區(qū)域縮小到5.0～5.6 Mb 的0.6 Mb 的區(qū)域內(nèi)（圖6），對該區(qū)域進行基因分型發(fā)現(xiàn)不同表型值存在等位基因差異性（-log10P=7.71，圖7）。通過基因注釋文件發(fā)現(xiàn)FPGT、NEGR1、ZRANB2、PTGER3、CTH、LRRC40、ANKRD13C、SRSF11、LRRC7等9 個基因。根據(jù)8 周齡鴨器官組織轉(zhuǎn)錄組[24]基因表達情況，發(fā)現(xiàn)基因FPGT在不同組織器官間存在表達差異（圖8），該基因在胸肌、腦和皮的表達相對其他組織器官較高，且在胸肌中的表達隨個體日齡的增加呈現(xiàn)不同變化趨勢。

圖7 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量8 號染色體表型與基因型對應(yīng)的連鎖不平衡分析

圖8 FPGT 在不同組織器官中的差異表達

將位于16 號染色體的致因變異區(qū)域縮小到3.4～3.6 Mb的0.2 Mb 區(qū)間內(nèi)（圖5）。該區(qū)間最高點SNP 出現(xiàn)明顯的基因分型（-log10P=8.64，圖8）且表型均值隨等位基因C 的表達呈現(xiàn)升高趨勢。

3 討 論

圖9 鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量16 號染色體表型與基因型對應(yīng)的連鎖不平衡分析

圖10 位于16 號染色體關(guān)聯(lián)性最強點的基因分型與表型分布差異

長期以來，為滿足人類營養(yǎng)需求，研究人員在改善肉質(zhì)方面做了大量工作，其中改善肌內(nèi)脂肪含量是肉品質(zhì)研究的主要方向。研究發(fā)現(xiàn)，豬肉中肌內(nèi)脂肪含量下降影響肉嫩度，同時使肉的系水力下降，對肉品質(zhì)造成明顯影響[25]。Cho 等[8]利用GWAS 和連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)MYH3基因?qū)φ{(diào)控肌內(nèi)脂肪含量的基因（CD36、LPL、FABP4、FTO、ADIPOQ）表達有影響。Madrid等[26]利用200k SNP 芯片鑒定出影響兔肌內(nèi)脂肪含量的基因EWSR1，該基因影響褐色脂肪細胞的生成和積累。Wang 等[27]、Lee[28]和Wang 等[29]分別研究了三黃雞、伯克郡豬和肉雞中不同亞型FABP基因?qū)游餀C體脂肪積累的影響。本研究借鑒前人關(guān)于肌內(nèi)脂肪的測定和分析，旨在鑒定影響鴨胸肌肌內(nèi)脂肪的候選基因。

胸肌是鴨肉產(chǎn)品的主要部分，本實驗選130 只北京鴨×野鴨F2代個體，發(fā)現(xiàn)胸肌肌內(nèi)脂肪含量與胸肌厚具有較高的相關(guān)性（r=0.57），表明肌內(nèi)脂肪的積累對胸肌厚度有重要影響。同時，估計肌內(nèi)脂肪含量的遺傳力為0.39，屬于中等遺傳力，表明該表型變異很大程度上受遺傳調(diào)控。在家禽中關(guān)于肌肉脂肪遺傳力的報道相對較少。陳繼蘭等[30]報道了北京油雞公雞的胸肌肌苷酸和肌內(nèi)脂肪含量遺傳力分別為0.23 和0.10，屬中等偏低遺傳力性狀。Won 等[31]報道伯克希爾豬的肌內(nèi)脂肪遺傳力為0.52，屬于高等遺傳力，與本實驗結(jié)果不同的原因是家禽與家畜肌內(nèi)脂肪積累存在生理差異[32]，家禽的肌內(nèi)脂肪沉積大多由腹脂轉(zhuǎn)化而來，并不是由原始的肌肉脂肪細胞增值分化而來，因此其肌內(nèi)脂肪遺傳力較低。本研究中所用實驗材料為北京鴨和野鴨的F2代，不同物種采食情況、運動狀況和遺傳機制存在較大差異，因此本實驗結(jié)果與前人[31]在北京油雞上的研究結(jié)果存在較大差異。

本實驗利用GWAS 和連鎖不平衡，鑒定影響肌內(nèi)脂肪的相關(guān)染色體區(qū)域。其中在1 號染色體的0.18 Mb（R2＞0.4）區(qū)域與肌內(nèi)脂肪關(guān)聯(lián)性較強，達到染色體顯著水平。在1 號染色體的0.18 Mb 區(qū)域最高點SNP 4 295 308 bp 處進行基因分型發(fā)現(xiàn)，TT 基因型的肌內(nèi)脂肪平均含量明顯高于CC 和CT 基因型，說明TT 基因型為優(yōu)勢基因型。在8 號染色體的0.6 Mb 區(qū)域內(nèi)包含的9 個基因中，F(xiàn)PGT基因在不同組織存在表達差異，其中在胸肌、腦和皮的表達較高，在胸肌中隨個體日齡的增加出現(xiàn)表達增高或降低的趨勢。Quirk 等[33]報道，F(xiàn)PGT基因編碼的蛋白質(zhì)參與由糖蛋白和糖脂轉(zhuǎn)換為L-巖藻糖的補救途徑，增加糖蛋白和糖脂的利用，是糖類和脂肪轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。TriFonova 等[34]研究發(fā)現(xiàn)FPGT基因與體重指數(shù)超標或肥胖有關(guān)。NEGR1基因調(diào)控胰島素和膽固醇的代謝，膽固醇代謝異常影響脂肪的沉積，在兒童[35]和小鼠[36]均表現(xiàn)出與機體肥胖癥相關(guān)。在16 號染色體的0.2 Mb 區(qū)間最高點SNP 進行基因分型，發(fā)現(xiàn)CC 基因型對應(yīng)的肌內(nèi)脂肪均值明顯高于AA 和AC 基因型，推測等位基因C 可能與脂肪代謝某種途徑相關(guān)。該研究得到的區(qū)間位點及其相關(guān)的基因還需要進一步的確定和驗證，對闡明脂肪代謝調(diào)節(jié)過程提供一定的參考價值。

綜上可知，鴨胸肌肌內(nèi)脂肪是一個由多基因控制且遺傳機制復(fù)雜的數(shù)量性狀。由于本實驗樣品數(shù)量有限，一定程度上影響結(jié)果分析的準確性，但結(jié)合其他參考文獻和實驗設(shè)計，本研究定位的顯著性區(qū)域?qū)罄m(xù)研究該性狀并闡明其遺傳機制仍具有參考價值，為后續(xù)分析驗證提供新的思路和方向。

4 結(jié) 論

本實驗對北京鴨×野鴨F2代鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量分析，發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪含量與胸肌厚、肌纖維面積和直徑具有較強的相關(guān)性，且肌內(nèi)脂肪含量具有中等遺傳力。對肌內(nèi)脂肪含量性狀進行GWAS 和連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)9 個SNP 與肌內(nèi)脂肪顯著相關(guān)，共發(fā)現(xiàn)FPGT、NEGR1、PTGER3、CTH等9 個基因，通過基因注釋發(fā)現(xiàn)FPGT和NEGR1基因均與動物機體體重指數(shù)超標或者肥胖相關(guān)，推測其可能影響脂肪的積累，同時影響鴨胸肌肌內(nèi)脂肪含量。