葛根總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫器官指數(shù)、IL-1β及TNF-α的影響分析

柏 琳，鄒天琪，張成義

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132000)

葛根主要活性成分有皂苷、黃酮、多糖、生物堿等。葛根總黃酮包括黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷酮。目前研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有抗炎、清除自由基、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力等功效[1]。因此可推測(cè)葛根總黃酮具有一定的抗炎活性。本研究采用弗氏完全佐劑建立佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，探討葛根總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫器官指數(shù)、IL-1β及TNF-α的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量190～210 g，購(gòu)于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(吉)2018-0001。燈光模擬晝夜交替，溫度23～25 ℃，濕度50%～60%，自由飲水和進(jìn)食。

1.1.2主要試劑：葛根總黃酮購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司，甲氨蝶呤片購(gòu)自上海信誼藥廣有限公司，弗氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，IL-6酶聯(lián)免疫吸附試劑盒和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與模型制備：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：60只SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常對(duì)照組12只，模型組48只。

1.2.2給藥劑量和方案：葛根總黃酮：大鼠(50 mg/kg、100 mg/kg)；陽(yáng)性對(duì)照藥甲氨蝶呤：大鼠(3 mg/kg)；通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)并參照前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，給藥劑量均為人體常用有效劑量經(jīng)體表面積折算。將不同濃度的葛根總黃酮混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉中，在對(duì)應(yīng)組致炎后(第12天)連續(xù)給藥16 d(第12～28天)，均按10 ml/kg計(jì)量灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組給予等量溶媒0.5%的羧甲基纖維素鈉灌胃，1次/d。

1.2.3大鼠免疫器官指數(shù)測(cè)定：造模后第28天，摘取大鼠脾臟和胸脾，生理鹽水反復(fù)沖洗后，紗布吸干，使用分析天平稱量濕重，計(jì)算免疫器官指數(shù)，包括脾臟指數(shù)和胸脾指數(shù)。計(jì)算公式為免疫器官指數(shù)=器官濕重(mg)/體重(g)×100%。

1.2.4大鼠血清IL-1β和TNF-α水平檢測(cè)：造模后第28天，心臟采血5 ml，注入離心管中，4 ℃靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心20 min，采集上層血清，-20 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清IL-1β、TNF-α水平，按試劑盒說(shuō)明書依次加入反應(yīng)液，上酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度值。同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出相應(yīng)的濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0軟件分析。計(jì)量數(shù)據(jù)為均數(shù)Mean、標(biāo)準(zhǔn)差STD、中位數(shù)Median，采用雙樣本t檢驗(yàn)比較兩組間計(jì)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1葛根總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的影響：模型組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；自給藥干預(yù)20 d后，與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中葛根總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯低于葛根總黃酮低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)在葛根總黃酮高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同給藥時(shí)間各組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

2.2葛根總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫器官指數(shù)的影響：給藥干預(yù)28 d后，模型組大鼠脾臟指數(shù)、胸脾指數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠的脾臟指數(shù)、胸脾指數(shù)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中葛根總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠脾臟指數(shù)、胸脾指數(shù)明顯低于葛根總黃酮低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大鼠脾臟指數(shù)、胸脾指數(shù)在葛根總黃酮高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 干預(yù)28 d后各組大鼠免疫器官指數(shù)比較

2.3葛根總黃酮對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β和TNF-α的影響：給藥干預(yù)28 d后，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中葛根總黃酮高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯低于葛根總黃酮低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大鼠血清IL-1β、TNF-α在葛根總黃酮高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 給藥干預(yù)28 d后各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

3 討論

佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型能夠較好地模擬人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，其中大鼠佐劑性關(guān)節(jié)模型應(yīng)用最為廣泛，適用于研究和篩選抗炎免疫藥物。繼發(fā)性足腫脹、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎時(shí)反映大鼠繼發(fā)性炎性反應(yīng)的兩個(gè)主要指標(biāo)。相關(guān)研究顯示，中樞免疫器官胸腺功能異常是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要發(fā)病機(jī)制之一，胸腺是T細(xì)胞分化、成熟的場(chǎng)所，當(dāng)其功能異常時(shí)會(huì)影響T細(xì)胞水平，影響人體正常的免疫炎癥狀態(tài)[2]。除胸腺之外，脾臟是另一個(gè)功能復(fù)雜的免疫器官，在人體神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[3]。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，胸腺和脾臟指數(shù)水平取決于淋巴細(xì)胞增殖的程度，可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱[4]。關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期IL-1β、TNF-α是關(guān)鍵調(diào)控分子[5]。相關(guān)研究顯示，IL-1在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其水平與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[6]。IL-1主要由IL-1α、IL-1β兩種蛋白質(zhì)組成，兩者的基因序列同源性并不高，其中IL-1β在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中高表達(dá)，能夠激活軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞，誘發(fā)趨化因子、細(xì)胞因子的釋放[7]。同時(shí)還能夠調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)，合成并分泌急性期蛋白，提升糖代謝水平，引發(fā)鈣流失、發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎性反應(yīng)和骨破壞。TNF-α是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織中主要的促炎因子，能夠引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)；患者血清TNF-α水平提升會(huì)增加滑膜炎、關(guān)節(jié)損壞的發(fā)生等下。TNF-α還能夠活化內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)趨化因子、細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等合成與分泌，抑制滑膜膠原合成及成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)生急性期蛋白，促進(jìn)血管生成和T細(xì)胞活性提升，誘發(fā)疼痛[8]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β 和 TNF-α在直接引發(fā)關(guān)節(jié)損傷和全身性炎癥反應(yīng)的同時(shí)，還能夠與其他炎性介質(zhì)之間產(chǎn)生協(xié)同作用，誘發(fā)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)[9]。

葛根是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，是野葛干燥的根，具有生津止渴、解肌退熱之功效。葛根總黃酮由葛根素、大豆甙等黃酮類化合物組成，是葛根發(fā)揮藥效學(xué)作用的主要活性成分。本研究成功建立了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，并以甲氨蝶呤干預(yù)作為陽(yáng)性對(duì)照組。研究結(jié)果顯示，葛根總黃酮低劑量組和高劑量組均能夠明顯抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足腫脹，降低多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)和脾臟指數(shù)、胸脾指數(shù)，其中葛根總黃酮高劑量組大鼠改善效果較葛根總黃酮低劑量組大鼠更明顯，與甲氨蝶呤陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異。提示葛根總黃酮能夠有效改善佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的癥狀，且改善效果呈劑量依賴性，隨著給藥劑量的增加效果逐漸明顯。進(jìn)一步分析顯示，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組；與模型組大鼠相比，葛根總黃酮低劑量組、葛根總黃酮高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平均明顯下降；其中葛根總黃酮高劑量組下降最明顯，與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)明顯差異。提示葛根總黃酮能夠明顯下調(diào)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠致炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)，降低大鼠血清中致炎因子含量，進(jìn)而改善炎癥癥狀。

綜上所述，葛根總黃酮能夠降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠繼發(fā)性足腫脹，改善免疫器官指數(shù)，降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-1β、TNF-α水平，上述結(jié)論可為相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。