睡眠剝奪后大鼠下丘腦Orexin-A神經(jīng)元的表達及其對學(xué)習(xí)記憶的影響*

倪麗艷 唐吉友

1.巨野縣人民醫(yī)院，山東 巨野 274900； 2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)指由于環(huán)境或自身原因?qū)е聸]有充足睡眠的一種狀態(tài)，是現(xiàn)代社會的普遍現(xiàn)象。研究表明SD會降低人及實驗動物的學(xué)習(xí)能力并損害記憶[1-3]。然而導(dǎo)致SD損害學(xué)習(xí)記憶的機制目前尚不完全清楚。Orexin-A是下丘腦外側(cè)區(qū)分泌的一種神經(jīng)肽，Orexin-A的重要作用是調(diào)節(jié)睡眠/覺醒[4]，睡眠剝奪可激活Orexin神經(jīng)元[3,5]，正是由于Orexin的發(fā)現(xiàn)，失眠的概念由睡眠失調(diào)轉(zhuǎn)為過度覺醒[6]。另有研究表明，Orexin-A與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[7]。

為進一步探討下丘腦Orexin-A的變化在睡眠剝奪影響學(xué)習(xí)記憶中的作用，本研究中使用跑步機剝奪睡眠的方法使大鼠的非快速眼球運動(non-rapid eyes movement，NREM)和快速眼球運動(rapid eyes movement，REM)睡眠減少[8]，觀察下丘腦Orexin-A的表達，并利用Morris水迷宮測試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物及分組

健康成年雄性 Wistar大鼠，質(zhì)量(200±20)g，由山東濟南朋悅實驗動物有限公司提供。隨機分為空白對照(CC)組、環(huán)境對照(TC)組、睡眠剝奪(SD)組。大鼠均在12 h光亮/黑暗條件、22～25 ℃環(huán)境溫度下分籠喂養(yǎng)。

1.1.2主要試劑與儀器

水迷宮設(shè)備(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司)；跑步機(ZH-PT型多功能跑臺系統(tǒng)，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；顯微鏡(OLYMPUS，日本)。兔抗 Orexin-A多克隆抗體(Cell Signaling Technology，CST)，山羊抗兔IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1睡眠剝奪

采用間歇式跑步機系統(tǒng)對大鼠進行72 h全睡眠剝奪，跑步機的傳送帶上方0.6 cm處為有機玻璃分隔成大小相等的鼠籠(28 cm×28 cm×40 cm)，籠頂扣上柵欄式鼠籠蓋，可放置飼料和水瓶，跑步機的傳送帶形成鼠籠的底。當(dāng)大鼠在跑步機上時，可以自由獲取食物和水。動物房光照/黑暗周期為12 h∶12 h，光照時間為8:00～20:00，動物房溫度22～24℃，濕度60%～70%，避免噪音。跑步機速度設(shè)定為10 cm/s。SD組設(shè)定運行3 s，停止12 s；TC組設(shè)定運行15 min，停止60 min，允許TC組大鼠獲得持續(xù)的休息時間，但跑步的總距離相等。運行和停止循環(huán)進行。

1.2.2Morris水迷宮試驗

采用Morris水迷宮(MWM)檢測SD后大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。水迷宮裝置由一個直徑150 cm、深80 cm的圓形水池組成，分為4個大小相等的象限；池內(nèi)水深40 cm，水溫(24±1)℃；水面以上每個象限池壁中心位置處各張貼1個不相同的醒目標(biāo)記。水面下1 cm隱藏著一個直徑10 cm的黑色圓形平臺，該平臺的位置在整個試驗過程中保持不變。

1.2.2.1定位航行試驗 測試大鼠對水迷宮的學(xué)習(xí)能力。根據(jù)水池中每個象限的標(biāo)記，訓(xùn)練大鼠尋找隱藏在水面下的平臺。選擇每個象限的醒目標(biāo)記下方為入水點，將大鼠面向池壁放入水中。象限選擇是隨機的，每個象限都有1次機會。每次實驗時，將一只大鼠放入水池中，允許其在水下搜索平臺的最長時間為120 s，大鼠發(fā)現(xiàn)平臺后允許其在平臺上停留30 s。如果在120 s內(nèi)未能找到平臺，則將其引至平臺，記錄其逃避潛伏期為120 s。4個象限的平均逃避潛伏期為大鼠學(xué)習(xí)能力的每日結(jié)果。

1.2.2.2空間搜索試驗 測試大鼠對平臺空間位置的記憶能力。在訓(xùn)練后第6天進行，測試只進行1次，測試時間為120 s。將隱藏的平臺從水迷宮中移走，選平臺相對象限為入水點。記錄每只大鼠的目標(biāo)象限停留時間和穿越原平臺位置次數(shù)。

1.2.3免疫組化

睡眠剝奪后3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，沿腹中線剪開胸骨，暴露心臟，用16號針頭穿刺通過左心室至升主動脈，大彎鉗夾住針頭固定，再用剪刀剪破右心耳，先用0.9%生理鹽水快速沖洗，直至流出的液體為無色透明的澄清液，再灌注含4%多聚甲醛0.1 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)，斷頭取腦后在10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片。組織切片預(yù)處理后行抗原修復(fù)，3%H2O2去離子水孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗5 min×3次，加兔抗 Orexin-A多克隆抗體 (1∶1000, CST)，4 ℃過夜，PBS沖洗5 min×3次，加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次，加生物素-卵白素-HRP復(fù)合物ABC，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，脫蠟水化組織切片，甘油封片，顯維鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠下丘腦Orexin-A陽性神經(jīng)元表達

2.1.1Orexin-A神經(jīng)元形態(tài)

在光鏡下觀察到大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)大量胞質(zhì)染成棕黑色的細胞,為Orexin-A神經(jīng)元的陽性表達。SD組大鼠的Orexin-A神經(jīng)元的細胞大小、著色深度及細胞核大小與 CC組相比未見明顯差異，見圖1。

圖1 下丘腦Orexin-A神經(jīng)元的表達(A為CC組；B為TC組；C為SD組)

2.1.2下丘腦Orexin-A神經(jīng)元數(shù)量

SD、CC及TC組大鼠下丘腦Orexin-A陽性細胞數(shù)分別為623.00±7.54129、426.40±31.16569、457.00±4.73254，SD組較CC及TC組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖2。

圖2 大鼠下丘腦Orexin-A神經(jīng)元的表達數(shù)量比較(與TC和CC組比較，＊P<0.001 )

2.2 Morris水迷宮檢測結(jié)果

2.2.1定位航行試驗結(jié)果

SD結(jié)束后行水迷宮試驗檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)能力，隨著訓(xùn)練天數(shù)增加，各組大鼠的逃避潛伏期逐漸縮短。SD組大鼠同一天的逃避潛伏期與CC組和TC組相比延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1，圖3。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期比較

圖3 各組大鼠平均逃避潛伏期比較(與CC和TC組比較，＊P<0.01)

2.2.2空間搜索試驗結(jié)果

CC、TC和SD組大鼠穿越平臺象限次數(shù)分別為(22.0625±2.86284)、(22.1875±2.53558)和(12.8750±2.30579)次，平臺所在象限游泳時間分別為(54.5169±3.88937)、(54.3131±3.24989)和(46.3781±4.11376)s， 與TC和CC組相比，SD組穿越平臺象限次數(shù)和平臺所在象限游泳時間減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4，5。

圖4 各組大鼠穿越平臺次數(shù)(與CC和TC組比較，＊P<0.01)

圖5 各組大鼠平臺象限的停留時間(與CC組和TC組比較，＊P<0.01)

3 討 論

有研究表明，SD導(dǎo)致實驗動物學(xué)習(xí)記憶能力下降，表現(xiàn)為一些行為學(xué)任務(wù)下降，如Morris水迷宮任務(wù)[3]、逃避任務(wù)[9]、徑向水迷宮任務(wù)[10]等。本研究結(jié)果表明，在Morris水迷宮測試中，72 h SD的大鼠逃避潛伏期延長，平臺穿越次數(shù)及目標(biāo)象限停留時間減少，提示72 h SD損害Morris水迷宮試驗中大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。我們的研究結(jié)果還表明，72 h SD后大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)Orexin A分泌增多，同時伴隨Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)記憶能力的損害。我們推測下丘腦Orexin A的過度表達可能在睡眠剝奪影響海馬依賴性空間學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮重要作用。

Orexin，又稱hypocretin，是由下丘腦外側(cè)區(qū)的Orexin前體產(chǎn)生的一種神經(jīng)肽，包括Orexin A和Orexin B，其中Orexin A的生物活性相對穩(wěn)定，其通過激活兩個G-蛋白耦聯(lián)受體Orexin-1受體(OX1)和 Orexin-2受體(OX2)發(fā)揮其生物學(xué)作用[11]。近年來研究表明，Orexin及其受體不僅參與睡眠/覺醒狀態(tài)的調(diào)節(jié)[12-13]，還與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[14-17]。Orexin在調(diào)節(jié)睡眠和覺醒中的作用的研究較多，有研究顯示Orexin缺乏可導(dǎo)致猝倒型發(fā)作性睡病(以過度嗜睡、睡眠發(fā)作、猝倒發(fā)作和睡眠片段化為主要表現(xiàn))[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)患者維持覺醒狀態(tài)時Orexin神經(jīng)元放電，睡眠時(包括NREM和REM期)停止放電[19]。REM期SD激活Orexin神經(jīng)元，導(dǎo)致Orexin合成/釋放增加，Orexin受體表達增加[20-21]。Orexin對學(xué)習(xí)記憶的影響研究觀點不完全一致。Aou等[16]的研究表明，Orexin-A通過影響海馬CA1突觸的長時程增強抑制損害空間記憶能力。Akbari等[22]的研究則發(fā)現(xiàn)，海馬CA1注射Orexin-1受體拮抗劑損害Morris水迷宮任務(wù)中的記憶的存儲、鞏固和提取，似乎提示內(nèi)源性O(shè)rexin-A促進大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶。Akbari等[23]的另一項試驗發(fā)現(xiàn)CA1區(qū)或DG區(qū)注射Orexin-1受體拮抗劑后記憶受損，進一步證實內(nèi)源性O(shè)rexin-A在學(xué)習(xí)中發(fā)揮重要作用，也提示Orexin-1受體在大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮重要作用。另外某些病理情況下注射Orexin-A可改善記憶，如海馬內(nèi)注射Orexin-A可減輕辣椒素治療引起的學(xué)習(xí)記憶障礙[24]。臨床上Orexin受體拮抗劑Belsomra (suvorexant)已被FDA批準用于治療失眠[25]，研究表明治療范圍內(nèi)的Orexin受體拮抗劑DORAs促進睡眠且不影響認知功能[26]。我們推測體內(nèi)Orexin A維持動態(tài)平衡，Orexin A不足或過度增多都可能導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

綜上，睡眠剝奪損害大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的機制可能與下丘腦Orexin A的過度表達有一定關(guān)系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突