順鉑腹腔熱灌注化療對人胃癌細胞系凋亡的影響及其作用機制*

王法寶 夏澤亮 褚 亮 周少波 許兆龍 蔣 磊 單二波 周超毅

蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233000

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率均較高。在我國，局部進展期和晚期胃癌占絕大部分，極易復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，預(yù)后很差[1-2]。其中，腹膜轉(zhuǎn)移是局部進展期胃癌常見的進展方式，而晚期胃癌也以合并腹膜轉(zhuǎn)移為疾病進展的表現(xiàn)方式[3-4]。針對胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移的病例，目前尚缺乏令人滿意的治療措施。近年來，腹腔熱灌注化療(hyperthermic intraperitoneal chemotherapy，HIPEC)在臨床上得以應(yīng)用，它是將含有化療藥物的灌注液注入腹腔，輔以灌注機維持恒溫、循環(huán)灌注，并使灌注液充盈腹腔達一定時間，以達到預(yù)防和治療腹膜癌、腹腔腫瘤、惡性腹水的目的[5-6]。但HIPEC治療胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移的臨床療效尚不明確，其作用機制亦缺乏實驗數(shù)據(jù)支持。由于順鉑具有抗瘤譜廣及抗癌活性高的優(yōu)點，且可兼顧靜脈給藥和胸、腹腔給藥兩種途徑，是臨床上常用的HIPEC藥物之一。本課題擬通過建立胃癌細胞體外作用模型來觀察熱灌注化療對胃癌細胞的形態(tài)、凋亡比率以及胃癌細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響，以探究腹腔熱灌注化療對胃癌細胞的影響及其可能的分子機制，以期為臨床上HIPEC治療胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移提供理論和實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

SGC-7901細胞株(中喬新舟有限公司，貨號：ZQ0062)。

1.2 實驗試劑與儀器

試劑：細胞培養(yǎng)基，購自中杉金橋有限公司，貨號：A02；胎牛血清，購自Gibco公司，貨號：10099-141；Hoechst染色試劑盒，購自碧云天公司，貨號：C0057；CCK-8試劑盒，購自碧云天公司，貨號：C1245；Caspase-3一抗，購自Cell Signaling Technology，貨號：9662；Bcl-2一抗，購自Cell Signaling Technology，貨號：15071；Bax一抗，購自Cell Signaling Technology，貨號：5023；Bid一抗，購自Cell Signaling Technology，貨號：8762；β-actin一抗，購自碧云天公司，貨號：C1035；儀器：流式細胞儀，購自美國貝克曼庫爾特公司；倒置熒光顯微鏡，購自奧林巴斯；高速冷凍離心機，購自貝克曼；轉(zhuǎn)膜儀，購自BIO-RAD。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

將SGC-7091細胞置于完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)(10%胎牛血清)，培養(yǎng)條件為：5%CO2，37 ℃，間隔2～3 d進行細胞傳代。將傳代的SGC-7091細胞調(diào)整密度為5×105個/mL，取100 μL細胞接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)。將細胞分為對照組、順鉑組、熱療組以及熱化療組，其中順鉑組：處理濃度為100 μg/L，熱療組：43 ℃，90 min；熱化療組：順鉑(100 μg/L)，43 ℃，90 min。

1.4 CCK-8檢測細胞活力

根據(jù)1.3實驗方法學(xué)的分組處理，96孔板設(shè)置6組復(fù)孔，共3批次進行細胞活力實驗。酶標儀設(shè)置檢測波長450 nm檢測各組細胞的吸光度值(OD)，細胞活力(OD)=實驗組細胞OD值-陰性對照組OD值。

1.5 Hoechst染色

按照試劑盒操作說明書進行。

1.6 流式細胞術(shù)

培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞上清液；PBS洗2次，消化并收集細胞，與上清液混合；2000 r/min 離心5 min，PBS洗2次，各組加入400 μL Annexin-V結(jié)合液，重懸細胞；每組加入Annexin-V-EGFP染色液 5 μL，在4 ℃條件下避光孵育15 min，加入10 μL PI，在4 ℃下避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡比率。

1.7 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達

將處理完畢的SGC-7901細胞清洗后放置于研磨管內(nèi)，按照合適的比例加入細胞裂解液放置于冰上裂解40 min，期間每間隔5 min進行細胞渦旋振蕩保證裂解完全，將裂解后的離心管放置于離心機內(nèi)，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，得到細胞上清液。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育Caspase-3一抗(1∶1000)，Bax一抗(1∶1000)、Bid一抗(1∶1000)和Bcl-2一抗(1∶1000)，于4℃過夜，洗膜，孵育對應(yīng)的二抗，室溫孵育60 min，TBST洗膜5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照，最后采用Image J軟件分析相關(guān)蛋白灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 熱化療對SGC-7901細胞活力的影響

通過CCK-8檢測各組細胞活力發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，其余3組細胞活力均顯著降低(P<0.01)；與順鉑組相比，熱療組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，熱化療組活力顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞活力比較

2.2 熱化療對SGC-7901細胞凋亡率的影響

通過Hoechst染色檢測顯示，與對照組相比，其余3組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與順鉑組相比，熱療組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，熱化療組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；見圖1、表2。流式細胞儀檢測顯示，與對照組相比，其余3組細胞凋亡率亦顯著升高(P<0.01)；與順鉑組相比，熱療組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，熱化療組細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；見圖2、表3。

圖1 Hoechst染色觀察SGC-7901細胞凋亡情況(×400)(A為對照組；B為順鉑組；C為熱療組；D為熱化療組)

表2 Hoechst染色檢測各組細胞凋亡情況

表3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率的比較

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況(A為對照組；B為順鉑組；C為熱療組；D為熱化療組)

2.3熱化療對SGC-7901細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blot檢測SGC-7901細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，其余3組Caspase-3、Bax和Bid表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與順鉑組相比，熱療組相關(guān)蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，熱化療組Bax表達顯著升高(P<0.05)。見圖3。

A.Western blot條帶；B.蛋白相對表達量。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與順鉑組相比，#P<0.05。

3 討 論

HIPEC是以精準控溫為核心，集化療、熱療、機械沖洗為一體的獨特治療手段，將含化療藥物的灌注液精準恒溫、循環(huán)灌注、充盈腹腔并維持一定時間，可以達到防治腫瘤腹膜種植轉(zhuǎn)移的目的[7]。研究表明，HIPEC殺死和抑制腹腔內(nèi)癌細胞主要機制涉及增加化療藥物與腹腔內(nèi)癌細胞的接觸概率，提高化療藥物的殺傷力。另外，熱效應(yīng)可以抑制腫瘤的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)，從而起到殺死腫瘤細胞的作用。但是，目前國內(nèi)外關(guān)于HIPEC的研究以臨床研究為主，有關(guān)HIPEC對體外腫瘤細胞的殺傷作用研究較少。因此，本課題通過體外探究HIPEC對胃癌細胞系SGC-7901的作用，進而為臨床HIPEC治療提供可靠依據(jù)。

本研究首先通過對SGC-7901細胞進行細胞活力實驗，結(jié)果顯示，與對照組相比，順鉑組、熱療組和熱化療組細胞活力顯著降低；與順鉑組相比，熱化療組細胞活力顯著降低。以上研究初步證實，熱化療能夠更加顯著的抑制SGC-7901細胞的增殖。細胞凋亡與增殖的失衡是腫瘤過度生長的主要原因[8]，為此，實驗進一步探究HIPEC對細胞凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，順鉑組、熱療組和熱化療組細胞凋亡率均顯著升高；與順鉑組相比，熱化療組細胞凋亡率顯著升高。Caspase-3、Bax、Bid和Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白[9]。與正常細胞株相比，胃癌細胞株Caspase-3、Bax、Bid表達顯著降低，Bcl-2表達顯著升高[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，順鉑組、熱療組和熱化療組Caspase-3、Bax、Bid均顯著升高，Bcl-2表達顯著降低；與順鉑組相比，熱化療組Bax表達顯著升高。

綜上所述，順鉑腹腔熱灌注化療能夠通過促進Caspase-3、Bax和Bid表達，下調(diào)Bcl-2，促進SGC-7901細胞凋亡。以上研究結(jié)果將進一步為HIPEC治療胃癌伴腹膜轉(zhuǎn)移的機制提供實驗依據(jù)，為胃癌持續(xù)HIPEC的臨床推廣應(yīng)用提供理論和實驗支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突