丹酚酸B改善糖尿病血糖波動模型大鼠心肌損傷的作用*

趙夢秋 任尤楠 陶善珺 鄭書國

1. 安徽衛(wèi)生健康職業(yè)學院藥學教研室，安徽 池州 247009；2. 皖南醫(yī)學院藥理學教研室，安徽 蕪湖 241002

糖尿病心肌病(DCM)是一類以心肌細胞肥大、凋亡以及間質(zhì)纖維化為表現(xiàn)的心肌特異性疾病，隨著糖尿病病程的延長可逐漸進展為心力衰竭。作為糖尿病的主要并發(fā)癥，DCM這一概念自1974年首次提出以來，一直受到學者持續(xù)關(guān)注。DCM 發(fā)病機制復雜，涉及心肌代謝紊亂、氧化應(yīng)激、鈣超載等多種反應(yīng)[1]，近年來越來越多的基礎(chǔ)及臨床證據(jù)表明炎癥在DCM發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2,3]。

丹酚酸B(salvianolicacid B，Sal B)是從治療心血管系統(tǒng)疾病的傳統(tǒng)中藥丹參中提取的活性成分，其抗炎及心血管保護作用已在多項基礎(chǔ)研究中證實[4-7]。但丹酚酸B是否能通過減輕心肌組織炎癥狀態(tài)改善DCM，目前未見報道。為了觀察丹酚酸B對DCM的影響，本研究采用高糖高脂飲食合并腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法建立大鼠糖尿病模型，并在此基礎(chǔ)上錯時給予胰島素或葡萄糖建立更符合臨床特點的糖尿病血糖波動模型，觀察丹酚酸B 對糖尿病大鼠心肌損傷的作用，為臨床應(yīng)用丹酚酸B 防治糖尿病心肌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與飼料 健康雄性SD 大鼠，體重220～240 g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(浙)2014-0001；高糖高脂飼料(含豬油10%、蔗糖10%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、普通飼料74%)，由南京市青龍山實驗動物中心提供。

1.1.2主要藥物與試劑 丹酚酸B(80%)，西安文竹生物科技有限公司；STZ，美國Sigma 公司；普通胰島素，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)一抗、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65亞基一抗、β-actin 一抗、Histone H3一抗，abcam公司；預染蛋白Marker(5～245 KDa)，GeneDire公司；0.45 μm PVDF膜，Millipore公司；二抗、蛋白定量試劑盒，代軒生物；白介素1β(IL-1β)檢測試劑盒、白介素6(IL-6)檢測試劑盒、白介素18(IL-18)檢測試劑盒、心肌天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，蘇州卡爾文生物科技有限公司；總抗氧化能力(TAC)檢測試劑盒，南京建成生物；其余試劑均為分析純。

1.1.3主要儀器 血糖儀、血糖試紙，長沙三諾生物傳感技術(shù)有限公司；酶標儀，北京普朗集團；微型高速離心機，杭州奧盛儀器有限公司；雙垂直電泳儀，北京六一儀器廠；全功能化學發(fā)光及熒光生物圖像分析系統(tǒng)，上海復日科技有限公司；顯微鏡，日本尼康。

1.2 方法

1.2.1糖尿病大鼠血糖波動模型制備[8]與給藥 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為正常組，喂以普通飼料，其余大鼠給予高糖高脂飼料。4周后，禁食12 h，按40 mg/kg一次性腹腔注射STZ。7天血糖基本穩(wěn)定后以隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型制備成功。將糖尿病大鼠隨機分為模型組、丹酚酸B 高劑量(SG)組及丹酚酸B 低劑量(SD)組。模型組和丹酚酸B 治療組繼續(xù)喂飼高脂飼料，于每日8:00及18:00檢測血糖值，并根據(jù)血糖水平，選擇皮下注射普通胰島素6～9 u(隨機血糖≥16.7 mmol/L)或灌胃給予葡萄糖2 g/kg(隨機血糖<16.7 mmol/L)，造成1日內(nèi)血糖水平大幅度波動模型。丹酚酸B治療組同時灌胃給予丹酚酸B 160 mg/kg和80 mg/kg，連續(xù)6 周。

1.2.2大鼠空腹血糖及血糖波動水平檢測[9]實驗結(jié)束前1日檢測各組大鼠8:00、12:00、16:00、18:00 和20:00血糖值。20:00后禁食，12 h后測大鼠空腹血糖。用血糖日平均水平、日平均血糖的標準差和最大血糖波動幅度評價各組血糖穩(wěn)定性。

1.2.3心肌組織病理學觀察 實驗結(jié)束時大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，收集心肌組織樣本。心肌組織多聚甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色觀察病理學改變。

1.2.4血生化指標檢測 腹主動脈取血后分離血清，按試劑盒說明書檢測血清LDH、IL-6水平。

1.2.5心肌組織生化指標檢測 心肌組織制備10%組織勻漿，按試劑盒說明書測定IL-1β、IL-18、TAC、Caspase-1，BCA法測定蛋白濃度。

1.2.6心肌組織NF-κB活化、NLRP3蛋白表達水平檢測 心肌組織使用RIPA 裂解液或細胞核蛋白抽提試劑盒，提取總蛋白或核蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后依次加入一抗及二抗。ECL化學發(fā)光法顯色，全功能發(fā)光儀器檢測曝光，分析光密度值。以與內(nèi)參光密度的比值作為蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠1日內(nèi)血糖變化

正常組大鼠血糖低且平穩(wěn)；模型組大鼠血糖在8:00處于較高水平，皮下注射胰島素后血糖持續(xù)降低，10:00后因藥物代謝及自由進食，血糖持續(xù)升高，于18:00注射胰島素后血糖再度下降；丹酚酸B 治療組血糖波動趨勢基本和模型組一致，提示糖尿病大鼠血糖波動模型建立成功。 圖1、表1所示為治療結(jié)束前1日各組大鼠血糖波動情況。

表1 各組大鼠1日內(nèi)血糖變化

圖1 各組大鼠1日內(nèi)血糖變化

2.2 丹酚酸B對大鼠血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖及最大血糖波動幅度明顯升高(P<0.01或P<0.05)，表明糖尿病血糖波動模型造模成功。與模型組相比，丹酚酸B治療組大鼠空腹血糖明顯降低(P<0.01或P<0.05)，但血糖波動情況仍然存在。具體見表2。

表2 丹酚酸B對大鼠血糖的影響

2.3 丹酚酸B對糖尿病大鼠心肌組織病理改變的影響

糖尿病大鼠心肌細胞排列稍紊亂，出現(xiàn)核固縮、核碎裂的現(xiàn)象，部分細胞核增大、淡染，提示糖尿病血糖波動模型大鼠出現(xiàn)了心肌細胞損傷。丹酚酸B治療組大鼠心肌損傷明顯減輕。見圖2。

A.正常組；B.模型組；C.丹酚酸B低劑量組；D.丹酚酸B高劑量組。

2.4 丹酚酸B對糖尿病大鼠炎癥因子、LDH水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠LDH及炎癥因子IL-6、IL-1β、IL-18水平均明顯升高(P<0.01)，丹酚酸B治療組上述指標均明顯改善(P<0.01)，見表3。

表3 丹酚酸B對大鼠炎癥因子、LDH水平的影響

2.5 丹酚酸B對糖尿病大鼠心肌組織Caspase-1水平的影響

表4顯示正常組大鼠心肌組織Caspase-1水平處于極低狀態(tài)，而模型組大鼠Caspase-1明顯升高(P<0.01)，丹酚酸B 治療組大鼠Caspase-1相比于模型組明顯降低(P<0.01)。

表4 丹酚酸B 對大鼠心肌組織Caspase-1水平的影響

2.6 丹酚酸B對糖尿病大鼠心肌組織NF-κB活化、NLRP3蛋白表達水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠心肌組織NF-κB核表達、NLRP3蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01或P<0.05)，丹酚酸B治療后NF-κB活化、NLRP3蛋白表達減少(P<0.01或P<0.05)，見圖3。

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.7 丹酚酸B對糖尿病大鼠心肌組織抗氧化能力的影響

由表5可見模型組大鼠心肌組織TAC比正常組大鼠明顯降低(P<0.01)，丹酚酸B 治療組大鼠TAC相比于模型組明顯升高(P<0.01)，表明丹酚酸B 治療提高了大鼠心肌組織的抗氧化能力。

表5 丹酚酸B 對大鼠心肌組織抗氧化能力的影響

3 討 論

糖尿病及其并發(fā)癥是危害人類健康的常見疾病。2018年Diabetologia公布的中國最新糖尿病流行病學數(shù)據(jù)顯示，我國糖尿病患病率已接近 11%，患者總數(shù)位居全球第一[10]，而患者對血糖的控制意識往往并不強[11]。在降糖治療過程中，由于飲食、藥物及治療依從性等多方面因素的影響，患者常常難以有效控制血糖波動[12]。而糖尿病并發(fā)癥及預后除與血糖水平有關(guān)，還與血糖波動性密切相關(guān)，血糖波動幅度越大，糖尿病并發(fā)癥越嚴重，預后越差[13-14]。因此，積極防治血糖波動造成的組織損傷成為防治糖尿病并發(fā)癥的可行措施之一。本研究通過對糖尿病大鼠錯時給予胰島素或葡萄糖建立更符合臨床特征的糖尿病血糖波動模型。研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠通過錯時給予胰島素或葡萄糖后，1天內(nèi)平均血糖、平均血糖標準差及最大血糖波動幅度均明顯升高(P<0.01)，表明糖尿病血糖波動模型建立成功。HE染色的結(jié)果顯示模型組大鼠心肌排列稍紊亂，出現(xiàn)核固縮、碎裂、增大、淡染的現(xiàn)象，同時血清LDH水平明顯升高，提示糖尿病血糖波動模型大鼠出現(xiàn)心肌組織損傷，而丹酚酸B治療組大鼠的心肌損傷明顯減輕，說明丹酚酸B可有效改善糖尿病血糖波動模型大鼠心肌損傷。

炎癥是參與糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的主要因素之一，炎癥小體作為炎癥活化的一種重要形式，在炎癥組織損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NLRP3炎癥小體是一類分布于細胞漿中的蛋白復合體，能感受細胞內(nèi)多種免疫相關(guān)信號刺激，參與細胞功能調(diào)控。文獻報道[15-16]NLRP3炎癥小體參與包括糖尿病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)展，有學者認為NLRP3炎癥小體可作為糖尿病心肌病的分子標志物[17]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、ASC和Caspase-1組成。NLRP3激活后與ASC結(jié)合，誘導pro-Caspase-1進行自我剪切生成活化的Caspase-1?；罨腃aspase-1將pro-IL-1β及pro-IL-18剪切成具有活性的IL-1β、IL-18，從而激活炎癥反應(yīng)，引起組織細胞損傷[18]。NLRP3的產(chǎn)生依賴于NF-κB通路[2]。當細胞接受相關(guān)刺激信號后，抑制 NF-κB的蛋白激酶被降解，NF-κB轉(zhuǎn)移至細胞核，上調(diào) NLRP3、pro-IL1β、pro-IL-18、IL-6等表達。高糖和高脂介導的活性氧(ROS)在這一過程中占主要作用。糖脂刺激心肌細胞內(nèi)ROS過度產(chǎn)生，ROS促使細胞內(nèi)DNA、蛋白等多種成分發(fā)生氧化修飾，同時還介導NLRP3炎癥小體的聚集和活化[19]。

本實驗結(jié)果顯示糖尿病血糖波動大鼠心肌組織抗氧化能力明顯降低，NF-κB核表達、NLRP3蛋白表達增加，Caspase-1、IL-1β、IL-18活性升高，同時血清炎癥因子IL-6水平升高，以上結(jié)果與文獻報道基本一致。丹酚酸B治療組大鼠上述指標均有明顯改善，這一結(jié)果與其減輕心肌損傷、減少LDH釋放作用相符，提示丹酚酸B減輕心肌損傷與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，丹酚酸B具有改善波動高糖引起的心肌細胞損傷的作用，機制可能與其提高心肌組織抗氧化能力、抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1通路，改善心肌炎癥狀態(tài)有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突