黃芪菟箭合劑對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及凋亡的影響

王亞榮,董兆珵,張 娜,劉寶利,郭 傳,尹德海*,樸元林#

(1北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科,北京 100730;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腎病科;3中國中醫(yī)科學(xué)院,廣安門醫(yī)院腎病科;*通訊作者,E-mail:yindehai123@126.com;#共同通訊作者,E-mail:pumchpyl@163.com)

糖尿病腎病(DKD)特征性臨床表現(xiàn)是蛋白尿,隨著病情的進(jìn)展,可能會(huì)出現(xiàn)蛋白尿伴動(dòng)脈高壓,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過率(GFR)下降和腎小球硬化,最終發(fā)展為終末期腎病(ESRD)[1]。DKD是糖尿病(DM)患者死亡的主要原因,也是ESRD的主要原因,約有30%-47%的DKD往往發(fā)展為ESRD[2]。足細(xì)胞附著于腎小球基底膜的外側(cè),是維持腎小球?yàn)V過屏障完整性的重要細(xì)胞,其結(jié)構(gòu)和功能的異常參與了蛋白尿的發(fā)生發(fā)展[3-5]。因此,足細(xì)胞的損傷被認(rèn)為是DKD的始動(dòng)環(huán)節(jié),對于尋找足細(xì)胞損傷的機(jī)制,預(yù)防其結(jié)構(gòu)和功能的異?；蛟S是尋找DKD有效治療方案的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)的DKD治療方法如控制飲食、降低血糖水平以及藥物治療[6]的療效有限,并不能夠延緩或阻止DKD的進(jìn)展[7]。因此,研究DKD的發(fā)病機(jī)制,探討DKD的防治措施具有十分重要的臨床意義。既往已有諸多臨床觀察證實(shí)了中藥在DKD的預(yù)防和治療中起著重要作用[8,9],因而目前許多DKD患者采用中西醫(yī)結(jié)合的綜合治療方案。本課題組已在前期實(shí)驗(yàn)證明了中藥菟箭合劑可以通過抑制腎小球TGF-β1的表達(dá)和腎皮質(zhì)蛋白激酶C的活性而顯著降低糖尿病大鼠模型尿蛋白水平[10,11],而黃芪及其提取物對DKD亦有良好的治療作用[12]。黃芪菟箭合劑(Huangqi Tujian decoction,HTD)是一種常用的中藥處方,其成分包括生黃芪、菟絲子、鬼箭羽、漢防己,已被廣泛應(yīng)用于臨床治療。本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,首次在體外研究觀察HTD,即已證實(shí)對降低蛋白尿有明確療效的中藥黃芪與菟箭合劑的中藥聯(lián)合處方,對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷及凋亡機(jī)制的影響,以其為HTD的臨床應(yīng)用及DKD足細(xì)胞損傷的可能機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

永生化小鼠腎小球足細(xì)胞,由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院的劉寶利教授提供。HTD配方顆粒購自四川新綠醫(yī)藥科技有限公司,對應(yīng)中藥飲片每日處方劑量含黃芪30 g,菟絲子15 g,鬼箭羽30 g,漢防己10 g。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司,胎牛血清、0.25%胰蛋白酶EDTA消化液和含5%DAPI抗熒光衰減封皮劑購于美國Gibco公司,Alexa Fluor 594購于美國Thermo Fisher公司,WES試劑盒購于美國Protein Simple公司,BCA蛋白定量試劑盒購于中國上海碧云天生物技術(shù)公司,CytoTox96Non-Radioactive試劑盒購于美國Promega公司,兔抗鼠Nephrin多克隆抗體(ab58968)購于美國Abcam公司,兔抗鼠ZO-1多克隆抗體(21773-1-AP)購于美國Proteintech公司,兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(10745-1-AP)購于美國Proteintech公司,兔抗鼠Caspase多克隆抗體(19677-1-AP)購于美國Proteintech公司,山羊抗兔IgG(ZF-0511)購于中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,鼠GAPDH抗體(60004-1-Ig)購于美國Proteintech公司。

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司),超速離心機(jī)(美國Beckman公司),Gen5酶標(biāo)儀(美國BioTek公司),熒光顯微鏡(LSM800,德國ZEISS公司),WES全自動(dòng)蛋白表達(dá)分析儀(美國Protein Simple公司)。

1.4 HTD凍干粉的制備

將HTD配方顆粒在100 ℃下加熱煎煮3次,每次2 h,用紗布過濾后合并3次濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液減壓濃縮至膏狀(溫度設(shè)定50 ℃,轉(zhuǎn)速設(shè)定40 r/min),隨后將浸膏置于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥,工藝流程如下:在-20 ℃處預(yù)凍2 h,在-25 ℃處升華干燥48 h,5 ℃解析干燥20 h。干燥結(jié)束后關(guān)閉真空泵,收集干燥粉末樣品,-20 ℃密封保存。

1.5 足細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中取出足細(xì)胞,并迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間。將細(xì)胞在37 ℃水浴鍋中解凍,解凍后的足細(xì)胞轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿中,加入4 ml包含10%胎牛血清和50 U/ml干擾素γ的1640培養(yǎng)基,在包含5% CO2的33 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待足細(xì)胞長滿70%-80%以后可進(jìn)行傳代,加入包含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,在包含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞在10-14 d完全分化后,方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 乳酸脫氫酶(LDH)釋放率分析法檢測黃芪菟箭合劑的最佳藥物濃度

取對數(shù)生長期的足細(xì)胞,PBS清洗,胰蛋白酶在37 ℃培養(yǎng)箱消化3 min。待細(xì)胞消化完全后加入包含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心5 min。棄上清,加入包含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基均勻混合。取10 μl細(xì)胞液在鏡下計(jì)數(shù)。以0.8×104的密度接種于96孔板,每孔100 μl在37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h,待細(xì)胞完全貼壁后加入不同濃度的黃芪菟箭合劑(0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5 mg/ml)干預(yù)24 h,加入CytoTox96Non-Radioactive試劑孵育30 min,用酶標(biāo)儀測定每組在490 nm的吸光度值。

1.7 觀察高糖和HTD對足細(xì)胞形態(tài)的影響

為了觀察高糖和HTD對足細(xì)胞形態(tài)的影響,將足細(xì)胞隨機(jī)分為4組。未分化足細(xì)胞組加入包含10%胎牛血清和50 U/ml干擾素γ的1640培養(yǎng)基;分化足細(xì)胞組加入包含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基;高糖刺激組先加入包含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,待細(xì)胞分化良好時(shí),再加入30 mmol/L的葡萄糖;HTD刺激組先加入包含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,待細(xì)胞分化良好時(shí),再加入0.75 mg/ml HTD,孵育24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組足細(xì)胞形態(tài)。

1.8 免疫熒光分析足細(xì)胞Nephrin、ZO-1、Caspase、NF-κB的表達(dá)

為了定性觀察高糖和HTD對足細(xì)胞目標(biāo)蛋白Nephrin、ZO-1、Caspase、NF-κB的影響,我們進(jìn)行免疫熒光分析。將分化的足細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、高糖組和HTD組。對照組和高糖組分別加入1640培養(yǎng)基,HTD組加入0.75 mg/ml HTD,在37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h后,對照組、高糖組和HTD組分別再用5,30,30 mmol/L葡萄糖刺激。24 h后1 ml PBS洗滌3次,1 ml 4%多聚甲醛在4 ℃下固定20 min。用含0.1% Triton(PBST)的PBS洗3次,每次5 min。足細(xì)胞膜在室溫下用0.5%TritonX-100滲透30 min,PBST再次洗滌3次,每次5 min。1 ml 5%牛血清白蛋白(BSA)在室溫下阻斷細(xì)胞30 min,丟棄BSA,將足細(xì)胞與兔抗小鼠原代抗體在4 ℃下孵育24 h。丟棄一抗,PBS洗滌細(xì)胞3次,每次5 min。隨后,細(xì)胞與山羊抗兔二次抗體在37 ℃下孵育1 h。然后用5% DAPI染色足細(xì)胞核,用AlexaFluor594染色靶蛋白。最后,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.9 Western blotting分析足細(xì)胞Nephrin、ZO-1、Caspase、NF-κB的表達(dá)

為了定量觀察高糖和HTD對足細(xì)胞目標(biāo)蛋白Nephrin、ZO-1、Caspase、NF-κB的影響,我們進(jìn)行Western blotting分析。按照1.8的分組進(jìn)行干預(yù)。24 h后棄去培養(yǎng)基,收集細(xì)胞。將樣本在含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液中裂解30 min,12 000g離心10 min。收集上清液,并用BCA定量分析試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。隨后,使用WES試劑盒在北京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行Western blotting。參照WES試劑盒說明書,設(shè)定WES自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)分析設(shè)備溫度在18-24 ℃和濕度在20%-60%之間,以確保WES套件的正確性能。依次加入樣品緩沖液稀釋好的蛋白、一抗、二抗、發(fā)光液,最后在樣品板中加入500 ml洗滌緩沖液。樣品板在2 500g下室溫離心5 min后,將樣品板放入WES自動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)分析設(shè)備中,自動(dòng)運(yùn)行3 h。之后,我們使用Compass軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LDH釋放法篩選HTD的最佳藥物濃度

黃芪菟箭合劑濃度在0.75 mg/ml時(shí),其LDH釋放率最低,稱其為亞殺傷濃度(見圖1)。因此,0.75 mg/ml HTD被作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。

圖1 黃芪菟箭合劑(HTD)作用于足細(xì)胞最佳濃度Figure 1 The optimal concentratin of Huangi Tujian decoction(HTD) to podocytes

2.2 高糖和HTD凍干粉對足細(xì)胞形態(tài)的影響

與未分化的足細(xì)胞相比,分化的足細(xì)胞胞體和細(xì)胞核明顯增大,形態(tài)從紡錘體改為星狀;與正常組相比,高糖組足細(xì)胞形態(tài)明顯改變,部分細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡或壞死(見圖2),提示高糖環(huán)境可誘導(dǎo)足細(xì)胞造成損傷,而HTD組足細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,結(jié)果表明HTD凍干粉對足細(xì)胞形態(tài)沒有明顯影響。

圖2 高糖和HTD對足細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 2 Effect of high glucose and HTD on the morphology of podocytes

2.3 HTD對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin和ZO-1的影響

與正常組相比,高糖組的足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin和ZO-1的表達(dá)顯著降低(P<0.05),而與高糖組相比,HTD組Nephrin和ZO-1蛋白水平顯著升高(P<0.05,見圖3)。這些結(jié)果表明HTD可以干預(yù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

與對照組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05圖3 免疫熒光和Western blot檢測HTD對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞標(biāo)志蛋白Nephrin和ZO-1的影響Figure 3 Effect of HTD on podocyte-related protein Nephrin and ZO-1 induced by high glucose using immuno-fluorescence and Western blot

2.4 HTD對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡蛋白NF-κB和Caspase的影響

與正常組相比,高糖組足細(xì)胞凋亡蛋白NF-κB和Caspase的表達(dá)顯著升高(P<0.05),而與高糖組相比,HTD組NF-κB和Caspase蛋白水平顯著降低(P<0.05,見圖4)。這些結(jié)果表明高糖可以通過促進(jìn)足細(xì)胞凋亡造成其損傷,而HTD可以通過干預(yù)凋亡途徑減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

與對照組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05圖4 免疫熒光和Western blot法檢測HTD對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡蛋白NF-κB和Caspase的影響Figure 4 Effect of HTD on podocyte apoptosis-related proteins NF-κB and Caspase induced by high glucose using immunofluorescence and Western blot

3 討論

DKD是DM的常見并發(fā)癥,也是全球ESRD的主要原因[13,14],嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量和生命安全[15]。足細(xì)胞,即腎小囊臟層上皮細(xì)胞,它附著于腎小球基底膜的外側(cè),連同血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基膜一起構(gòu)成了腎小球血液濾過屏障,是維持腎小球正常濾過功能的主要細(xì)胞類型之一[16]。正常機(jī)體的腎小球足細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞,一旦受損就不會(huì)再生,體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞也不能增殖,因此我們實(shí)驗(yàn)均采用永生化的腎小球足細(xì)胞[17,18]。而足細(xì)胞的損傷和凋亡也是引發(fā)DKD的重要因素[17,19]。因此,保護(hù)足細(xì)胞對DKD的防治具有重要作用。目前,DKD的臨床治療方案主要包括藥物治療[20]和改變生活方式[21],而中藥由于其治療DKD的有效性近年來備受關(guān)注[22]。HTD是一種常用的中藥處方,其成分生黃芪及菟箭合劑均已在前期研究中證實(shí)了其減輕尿蛋白水平的有效性[12],但其對足細(xì)胞的作用以及機(jī)制尚未有學(xué)者進(jìn)行研究?；诖?本研究首次在體外研究了HTD對足細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究首先利用LDH釋放率檢測HTD作用于足細(xì)胞的最佳藥物濃度為0.75 mg/ml,且在該濃度時(shí)對足細(xì)胞形態(tài)無明顯影響,而高糖刺激會(huì)引起足細(xì)胞形態(tài)的破壞,導(dǎo)致部分細(xì)胞凋亡或壞死,因此我們用該濃度HTD刺激足細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

基于Nephrin和ZO-1和兩種連接蛋白在足細(xì)胞的形態(tài)與功能中的重要作用,本研究重點(diǎn)探討了該蛋白在足細(xì)胞的表達(dá)水平的變化。Nephrin是一種黏附蛋白,主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞胞間連接處,是足細(xì)胞裂孔膜的關(guān)鍵成分,也是腎小球?yàn)V過屏障的主要成分。人類中的nephrin基因突變或動(dòng)物遺傳模型中的缺失均會(huì)導(dǎo)致足突形成發(fā)育失敗。諸多研究表明,在各種有蛋白尿表現(xiàn)的腎病和腎小球疾病患者與動(dòng)物模型中,Nephrin的表達(dá)降低,其對于成年成熟腎小球損傷后足細(xì)胞的恢復(fù)是必需的[23]。此外,糖尿病腎病患者的腎臟切片顯示Nephrin表達(dá)降低,并與疾病嚴(yán)重程度成比例[24]。由于在腎小球疾病中已證實(shí)足細(xì)胞減少與腎臟疾病病情進(jìn)展有關(guān),所以觀察到的Nephrin表達(dá)下降可能是由于足細(xì)胞密度下降所致。Verma等[23]進(jìn)一步證實(shí)Nephrin在維持足細(xì)胞間連接及足細(xì)胞損傷后重建連接過程中的重要作用,Nephrin表達(dá)下降會(huì)對足細(xì)胞損傷后的恢復(fù)能力造成負(fù)面影響,從而使其易于分離,參與蛋白尿的形成。ZO-1是一種連接蛋白,參與一些緊密連接的結(jié)構(gòu)組成及功能發(fā)揮,也在足細(xì)胞與裂隙隔膜的連接處表達(dá)。既往有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病動(dòng)物模型中可觀察到腎小球中ZO-1的表達(dá)降低且重新分布,證明ZO-1表達(dá)水平和定位的改變可能與糖尿病性蛋白尿的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[25]。腎臟中的腎小球足細(xì)胞起源于具有緊密連接的柱狀上皮細(xì)胞,在足細(xì)胞分化過程中,緊密連接被縫隙隔膜代替,縫隙隔膜形成于足突之間,并起著血液過濾屏障的作用。盡管在足細(xì)胞分化過程中抑制了最緊密連接成分的表達(dá),但始終表達(dá)包括ZO-1和ZO-2在內(nèi)的幾種成分,而足細(xì)胞ZO-1基因的特異性缺失會(huì)損害縫隙隔膜的形成,從而導(dǎo)致蛋白尿和腎小球硬化[26]。

本研究根據(jù)Nephrin和ZO-1和蛋白的表達(dá)水平間接評估足細(xì)胞的狀態(tài),觀察到高糖組Nephrin及ZO-1表達(dá)水平下降,遠(yuǎn)低于正常組,經(jīng)不影響足細(xì)胞形態(tài)的HTD干預(yù)后的足細(xì)胞在高糖環(huán)境刺激后,兩種蛋白的表達(dá)水平仍高于高糖組,進(jìn)一步證實(shí)了HTD干預(yù)可抑制高糖刺激所引起的Nephrin及ZO-1蛋白的表達(dá)水平下降,減少足細(xì)胞的損傷。

在高糖的長期刺激下,足細(xì)胞激活氧化應(yīng)激反應(yīng),釋放大量反應(yīng)活性氧(ROS),參與到足細(xì)胞凋亡中,這是DKD足細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因[27]。在DKD小鼠模型中,足細(xì)胞中Caspase的表達(dá)和Gasdermin D(GSDMD-N)的裂解顯著增加,Nephrin和Podocin蛋白的表達(dá)減少,足細(xì)胞足突的損失和融合,炎性細(xì)胞因子NF-κB增加[28],因此,在本研究中選擇Caspase和NF-κB評估足細(xì)胞的凋亡水平以闡明HTD對足細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制,發(fā)現(xiàn)高糖刺激后足細(xì)胞Caspase和NF-κB表達(dá)水平顯著提高,提示高糖刺激可誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能是持續(xù)的高糖可以促進(jìn)RAC1的激活,從而導(dǎo)致ROS釋放的增加和NF-κB的激活,從而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[29]。而經(jīng)HTD干預(yù)后再以高糖環(huán)境刺激,足細(xì)胞Caspase與NF-κB表達(dá)水平明顯低于高糖組,提示其可減少足細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)足細(xì)胞,減輕蛋白尿癥狀。除HTD外,已有研究證實(shí)梓醇可以通過抑制NOX4減輕ROS的產(chǎn)生,并抑制TLR4/MyD88和p38 MAPK信號通路來阻止NF-κB活化和轉(zhuǎn)移到核中,從而改善細(xì)胞凋亡和炎癥[30];雷公藤甲素也是通過抑制NF-κB/GADD45B信號傳導(dǎo)減弱蛋白尿和足細(xì)胞凋亡,這些研究都證明了NF-κB信號在細(xì)胞凋亡和炎癥中起重要作用,從另一個(gè)角度證明可抑制NF-κB表達(dá)的HTD有著保護(hù)足細(xì)胞、減輕蛋白尿的可能。

綜上所述,本研究證實(shí)了HTD可以減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷以及減少足細(xì)胞凋亡,通過保護(hù)足細(xì)胞,可以減少蛋白尿以及DKD的進(jìn)展,為今后臨床上中西醫(yī)結(jié)合治療DKD提供了新的方向。但同時(shí),本研究只是在細(xì)胞層次上證實(shí)了中藥黃芪菟箭合劑復(fù)方對足細(xì)胞的影響,具體的中藥有效成分以及相關(guān)通路仍然需要被進(jìn)一步探討,以便為臨床預(yù)防和治療DKD提供更有效的方案。