退化濕地土壤酶活性分析

劉立偉 光輝 葉姍 葉銀 梁薇

摘 要：選取退化濕地土壤樣本，分別對不同樣本的脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、過氧化氫酶及熒光素二乙酸酯酶活性進行了測定分析。結果顯示，過氧化氫酶與蔗糖酶的活性變化規(guī)律與土壤理化性質中的總氮和有機質含量變化特點基本保持一致。土壤酶在土壤的發(fā)生和發(fā)育以及土壤肥力的形成和演化過程中起著關鍵性作用，探究濕地退化過程中土壤酶活性特征，對于揭示長江中下游淺水湖泊濕地退化機理具有重要意義。

關鍵詞：武昌湖;濕地退化;酶活性

中圖分類號 P941.78文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）10-0134-05

Analysis of Soil Enzyme Activity in Degraded Wetland

LIU Liwei et al.

（School of Materials and Environmental Engineering， Chizhou University， Chizhou 247000， China）

Abstract： In this paper， soil samples of degraded wetlands were selected， and the urease， sucrase， phosphatase， catalase and luciferin diacetate enzyme activities of different samples were measured and analyzed. Experimental analysis found that the changes of the activities of catalase and sucrase were basically consistent with the changes of the total nitrogen and organic matter content in the physical and chemical properties of the soil. Soil enzymes play a key role in the occurrence and development of soil and the formation and evolution of soil fertility. By exploring the characteristics of soil enzyme activity in the process of wetland degradation， it is of great significance to reveal the degradation mechanism of shallow water lake wetlands in the middle and lower Yangtze River.

Key words： Wuchang Lake; Wetland degradation; Enzyme activity

1 引言

濕地生態(tài)系統(tǒng)是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最主要的碳庫之一，在全球氣候變化中起著關鍵性的作用，其具有強大的生態(tài)功能，具體體現在濕地社會價值、大氣水熱循環(huán)、截留沉降污染物、水源調蓄以及維護多樣性生物等方面。我國濕地面積約占世界濕地總面積的10%，位居亞洲首位，世界第4位[1]。近幾十年來，由于人類無序開發(fā)及不合理的利用，導致濕地面積急劇減少[2-3]，濕地生態(tài)系統(tǒng)結構和功能已發(fā)生了不同程度的退化[4]，部分濕地生態(tài)系統(tǒng)甚至消失。據水利部門調查得知，目前我國湖泊濕地只有20世紀50年代的1/3左右，河流濕地已消失了近3萬條。長江經濟帶是我國經濟實力最強的區(qū)域之一，也是我國湖泊、河流、沼澤等分布密集區(qū)，濕地面積達1154萬hm2，約占全國濕地總面積的20%。但與新中國成立初期相比，其湖泊濕地面積較萎縮了近120萬hm2，僅2000—2010年間，該區(qū)域的沼澤濕地就喪失了742.1km2，湖泊喪失220.7km2[5，6]。湖泊濕地的萎縮，將日益威脅著生態(tài)安全與經濟社會的可持續(xù)健康發(fā)展。

土壤酶是具有專性催化作用的蛋白質，幾乎參與了土壤中所有的生物化學過程，與有機物質分解、營養(yǎng)物質循環(huán)和能量轉移等密切相關[7，8]，在濕地生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要而復雜的作用。土壤酶主要來自微生物，可分為氧化還原酶類、水解酶類、轉移酶類和裂解酶類，其活性直接影響了分布微生物群落結構相關情況。因此，土壤酶活性可作為衡量濕地生態(tài)系統(tǒng)質量的指標之一[9]。

位于安徽省安慶市的武昌湖濕地，是皖西南沿江湖群的重要的組成部分，具有漁業(yè)養(yǎng)殖、調節(jié)徑流、改善氣候、區(qū)域旅游以及物種保護等重要的生態(tài)作用[10]。而近年來，濕地退化現象非常突出，湖面被大面積的菰草所占據，使得湖水面積減少了近70%，菰草的生長繁衍導致湖底變淺，泥沙淤積嚴重;涉水生物物種也因為湖泊濕地的景觀變化而減少，生物多樣性遭到破壞，直接影響了該地區(qū)的生態(tài)安全和區(qū)域可持續(xù)發(fā)展[11]。目前，有關土壤酶的領域目前研究較多的是酶的時空分布、酶的測定方法、影響酶的因素等方面，而關于退化濕地土壤酶活性方面的研究較少。為此，本研究以武昌湖濕地為對象，對土壤酶活性的特征進行了分析。

2 材料與方法

2.1 研究區(qū)概況 武昌湖位于安徽省西南部望江縣境內，是皖河水系中最大的一塊濕地。湖面東西長約28km，南北最大寬度8km。屬北亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)，四季分明，雨量充沛。該淡水湖濕地是以草本沼澤和湖泊為主的一塊濕地，東西長約20km，南北7.5km。1993年修建的跨湖公路將武昌湖分割為上湖和下湖2個區(qū)域。濕地植被建群種主要以挺水植物菰草為主，高度在0.8～2.1m，且生長茂盛，蓋度可達60%～70%，其他伴生種主要有蓮子草、愧葉萍、丘角菱、水鱉、浮萍等[12]。

2.2 樣品采集 本研究以武昌湖濕地菰草群落重新扎根在不同的微生物環(huán)境下生長后的菰草為對象，采取GPS定位，選擇7組不同的樣點S1、S1a、S2、S3、S4、S5、S6。S1、S1a、S2、S3、S4等5處長菰草，而S5、S6這2處未生長菰草。其中，S1、S1a、S2位于河灘邊，S1樣點取的是菰草根際土壤，該點較長時間處在有水環(huán)境中;S1a樣點取的是根際水下沉積物;S2土壤取的是菰草根際土壤，該點短時間內處在有水環(huán)境中;S3樣點位于河灘邊埂上，菰草根際只有在豐水期的時候才會處于有水環(huán)境中;S4處菰草常年漂浮于水上生長，且根須處在水中，含水量較高，根際土壤較少，未接觸到湖泊沉積物;S5、S6處未生長菰草，S5處位于河漫灘邊，只有豐水期的時候被淹沒;S6處位于河岸口，豐水期也不能被淹沒。這7組樣點的區(qū)別主要在于有無生長菰草，含水量的多少，根際土壤的多少（接觸水下沉積物的多少）。用取樣鏟從7組樣點各采集一份土壤裝入無菌袋中帶回后進行風干作為樣本，分別對這7個樣本土壤的脲酶、蔗糖酶、磷酸酶、過氧化氫酶以及熒光素二乙酸酯酶（FDA酶）的活性進行測定并分析。

2.3 測定項目與方法 采用比色法測定脲酶活性，硫代硫酸鈉滴定法測定蔗糖酶活性，磷酸苯二鈉比色法測定磷酸酶活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性，滴定法測定FDA酶活性。

2.3.1 脲酶測定 采用比色法測定脲酶，其操作步驟如下：稱取10g風干土樣（過1mm篩），同時將其放于容量瓶（100mL）之中，加入甲苯（2mL）2min，加入pH值為6.7的檸檬酸鹽緩沖液以及10%的尿素溶液（10mL），仔細混合后。將上述材料放于恒溫箱中，恒溫箱的溫度為38℃，并將其靜置24h，用蒸餾水（38℃）進行稀釋，此時應注意觀察其甲苯是否剛好在刻度之上，充分搖動之后過濾掉懸液并備用。在此基礎上基于水代替基質，對照土樣設計并進行試驗，設置沒有土壤的對照并檢驗其純度。在容量瓶中放置上述溶液，加入蒸餾水使之變成10mL，并加入苯酚鈉溶液及氯酸鈉溶液。將所制成的混合試劑放置20min，并通過稀釋混合物體直至刻度，選用1cm的比色槽，測定波長為578nm的比色并記錄出其讀數。此時可通過對比試試樣品的對照樣品消光值及上述樣品所獲得的消光值，并結合標準曲線獲得氨態(tài)氮量。脲酶的活性以24h后單位土重產生的NH3-N的重量（mg）表示。

2.3.2 蔗糖酶測定 采用硫代硫酸鈉滴定法測定土壤蔗糖酶活性，其具體操作步驟如下：稱取10g風干土樣（過1mm篩），同時將其放于容量瓶（100mL）之中，并加入甲苯（1.5mL）。長溫下放置15min之后，即可加入磷酸鹽緩沖液、蔗糖溶液（前者的pH值為5.5）在混合完成后，加其放入恒溫箱中（溫度同上均為37℃）并培養(yǎng)23個h，用蒸餾水（38℃）進行稀釋，此時應注意觀察其甲苯是否剛好在刻度之上，充分搖動之后過濾掉懸液并備用。在此基礎上基于水代替基質，對照土樣設計并進行試驗，設置沒有土壤的對照并檢驗其純度。在容量瓶中放置上述溶液，加入蒸餾水使之變成10mL。并加入苯酚鈉溶液及氯酸鈉溶液。將所制成的混合試劑放置60min，取未經過濾的透明液20mL，并測定出其原糖。在進行測定時，應注意區(qū)分庶糖溶液與無庶糖溶液。將待測液20mL同菲林溶液10mL一起加入三角瓶之中，同時混入蒸餾水（20mL）。將上述所形成的三角瓶及其材料均放于水浴中10min，取出三角瓶后將其放于自來水流下讓其自然冷卻25℃，此時即可加入1∶3的稀硫酸4mL以及碘化鉀溶液3mL，對上述混合液采用0.1mol/L硫代硫酸鈉進行滴定。一般以硫代硫酸鈉mg數說明24h單位土重消耗。

2.3.3 磷酸酶測定 采用磷酸苯二鈉比色法測定磷酸酶活性，其操作步驟如下：稱取10g風干土樣（過1mm篩），同時將其放于容量瓶（100mL）之中，加入甲苯（1.5mL）處理15min，在此基礎上需要液入緩沖液、磷酸苯二納溶液。同時將上述材料放于恒溫箱中，恒溫箱的溫度為38℃，并將其靜置24h，用蒸餾水（38℃）進行稀釋，此時應注意觀察其甲苯是否剛好在刻度之上，充分搖均勻之后過濾掉懸液并備用。在此基礎上基于水代替基質，對照土樣設計并進行試驗，設置水代替基質（10mL）對照并檢驗其純度。在容量瓶中放置上述溶液，加入緩沖液使之變成10mL，此后加水濾液，加入1mLGibbs試劑?；旌戏磻?，在靜置20min后，以刻度為標準稀釋混合物，并記錄其波長在578nm處24h的讀數，并做好記錄。對比對照樣品以及待測樣品兩者的消光值，即可求解出其酶活性以24h后單位土重釋放的酚的質量（mg）表示。

2.3.4 過氧化氫酶測定 采用高錳酸鉀滴定法檢測過氧化氫酶活性，其具體操作步驟如下：稱取10g風干土樣（過1mm篩），同時將其放于三角瓶之中（150mL）在其中注入氧化氫溶液、蒸餾水。設置對照即不加土樣，但是加入上述材料。此后即可塞緊瓶塞，并將其放于120r/min往返式搖床上，使其得以充分振蕩30min，此后需要注入硫酸（5mL1.5mol/L）使其終止反應，采用到處密濾紙進行過濾，利用高錳酸鉀溶液（0.002mol/L）進行滴定使之變成微紅色，以30min 1g土壤的高錳酸鉀的毫升數表示氧化氫酶活性。

2.3.5 FDA酶活（熒光素二乙酸酯酶活）測定 采用滴定法測定FDA酶活性，其操作步驟如下：稱取5g新鮮的土壤（過2mm篩），同時將其放于容量瓶新鮮土壤，置于三角瓶（50mL）中，同時加入15mL60mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH7.6），加入熒光素二乙酸（FDA）（0.2mL1000μg/mL）儲備液，并使其放于恒溫振蕩培養(yǎng)箱之中，培養(yǎng)20min待結束后可加入包含甲醇、氯仿的混合液（15mL）使其終止反應，加入瓶塞之后使之得以充分振蕩，在此基礎上可將混合液轉移至離心管（50mL）之中，2000r/min離心3min。過濾于50mL三角瓶，吸取1～10mL濾液按標準曲線繪制的操作手續(xù)，測定490nm處比色測定。基于1h的土壤以及150℃的干熱滅菌進行對照實驗土壤的基質。熒光素二乙酸酯酶活性，以20min每g土壤消耗熒光素的Hg數來表示。

3 數據分析

3.1 菰草根際土壤脲酶分布特征 脲酶屬于酰胺酶的一種，可用于說明土壤中氮素的循環(huán)現象，有助于分解肽鍵。與此同時，其土壤的微生物數量、脲酶活性以及總氮、有機質的含量等幾者之間均存在一定的聯系[9，13-14]。大多數細菌、真菌和高等植物均具有脲酶，它是土壤中主要的水解酶類。武昌湖濕地菰草根際土壤脲酶活性的大小按照S1>S1a>S3>S2>S4>S5>S6的規(guī)律逐漸降低（表1），其中樣點S1處為脲酶活性的最高值點，為0.042mg/g·h，樣點S6處的脲酶活性大小為0.017mg/g·h，是所有樣品中的最低值點。常年外在環(huán)境擾動較小的未生長菰草的樣點S5和S6的脲酶活性明顯小于其他的樣點，而S4樣點的脲酶活性與S5和S6的酶活性差異較小，這可能與S4樣點的微環(huán)境有關，該環(huán)境下的菰草常年長時間漂浮在水上生長，其根際僅存在少量的土壤，常年被水淹沒，而菰草需要的主要營養(yǎng)來源并不是根際土壤，從而導致S4處的脲酶活性與未長菰草區(qū)樣點S5和S6處之間的脲酶活性相接近，且與其他樣點間存在著明顯的差異（圖1）。武昌湖濕地菰草根際土壤脲酶活性的空間橫向變化規(guī)律同其土壤有機質含量的變化規(guī)律總體相類似，這與凝聚土壤腐殖質、脲酶有關[15]。

3.2 菰草根際土壤蔗糖酶分布特征 研究表明，土壤的蔗糖酶活性與下述均具有正相關的關系：其一是水溶性;其二是腐殖質;其三是微生物活動及其數量[13，16，17]。土壤中的蔗糖酶具有加速分解蔗糖，使之成為果糖以及葡萄糖的能力，提高土壤的熟化度即意味著可強化蔗糖酶的活性。蔗糖酶可用于說明土壤的肥力水平及其熟化程度。由圖2可知，土壤蔗糖酶活性在0.132～0.284mg/g·h，其蔗糖酶活性的最大值在S1樣點，樣點S6處的蔗糖酶活性最低。各樣點土壤蔗糖酶活性按照S1>S2>S1a>S4>S5>S3>S6的規(guī)律依次遞減（圖2）。樣點S5、S3、S6之間的土壤蔗糖酶活性基本相同，而這3種環(huán)境下土壤的含水率明顯低于其他各樣點，從而可得出土壤中水分含量可能成為影響該環(huán)境下土壤蔗糖酶活性的主導因子的結論。這與相關學者研究濕地土壤酶活性時所得到的結論基本保持一致[14，18-19]。

3.3 菰草根際土壤磷酸酶分布特征 有機磷在植物的磷素營養(yǎng)物質中占有一定的比例，而有機磷往往要在磷酸酶的酶促作用下才能夠進行水解，并轉化為可被植物直接利用的形態(tài)[20-21]。本實驗證實了土壤微生物具有礦化土壤中含磷有機物的作用，且有助于提升其磷酸活性，可用于說明包括磷在內的土壤肥力情況[22]。武昌湖濕地菰草根際土壤磷酸酶的活性在0.085～0.418mg/g/h，其中磷酸酶活性的最高值點是S6樣點，S1a處的磷酸酶活性最低，土壤磷酸酶活性按照S6>S5>S3>S1>S4>S2>S1a的變化規(guī)律依次遞減（圖3），這與根際土壤理化性質中含水率的大小分布規(guī)律基本相反，所以可得出土壤含水率可能在一定程度上抑制了土壤磷酸酶活性的結論。

3.4 菰草根際土壤過氧化氫酶分布特征 過氧化氫酶是一種用于氧化氫氧化合物的物質，且?guī)缀趺恳环N生物體中都含有這一物質。很多細菌體的過氧化氫酶細胞占比達到了1%以上，具有轉換能量、物質等作用。一般將其歸為氧化還原。與此同時其強度、土壤中的微生物等均會影響到其過氧化氫酶的活性，這可說明其在微生物學上的強度情況[22]。

武昌湖濕地菰草根際土壤過氧化氫酶活性水平在1.5～3.2mLKMnO4/g·min，樣點S1處的過氧化氫酶活性最高，而過氧化氫酶活性的最低值出現在樣點S6處。各樣點間過氧化氫酶活性按照S1>S2>S1a>S4>S5>S3>S6的順序依次遞減（圖4），各樣點間過氧化氫酶活性與樣點所處的微環(huán)境以及土壤的理化性質之間并未發(fā)現明顯的規(guī)律，這可能與土壤處于多相介質中且其環(huán)境極其復雜等因素具有一定的關系。另外，酶活性可能還受到季節(jié)、氧化還原電位、離子濃度以及土壤中的各種其他成分等直接或間接的，復合和多重的疊加影響[23，24]。

3.5 菰草根際土壤FDA酶分布特征 熒光素二乙酸是一種有可能被酶類水解的物質，比如脂肪酶、蛋白酶等等，形成酶促反應。學者將這一現象歸為FDA酶，基于土壤的生物總體活性一般可用FDA酶進行表征說明[22，25，26]。武昌湖濕地菰草根際土壤熒光素二乙酸酯酶活在0.86～8.23μg/g·20min，其中S5樣點的土壤熒光素二乙酸酯酶活性最低，S4樣點的土壤熒光素二乙酸酯酶活性最高，并且兩者之間的大小存在著明顯的差異。各樣點土壤的熒光素二乙酸酯酶活性按照S4>S1>S1a>S3>S2>S6>S5的規(guī)律依次遞減（圖5）。樣點S5、S6熒光素二乙酸酯酶活性無明顯差異，但這兩點與其他各樣點之間酶活性的差異較為明顯。S4樣點熒光素二乙酸酯酶活性顯著高于其他樣點，這可能是由S4樣點常年被水淹沒的特殊微環(huán)境所造成的。

4 結果與討論

武昌湖濕地菰草根際土壤脲酶活性大小在0.017～0.042mg/（g·h），各樣點間脲酶活性大小順序為S1>S1a>S3>S2>S4>S5>S6;根際土壤的蔗糖酶活性和過氧化氫酶活性在各樣點間規(guī)律表現高度一致，大小順序均為S1>S2>S1a>S4>S5>S3>S6，其中蔗糖酶活性為0.132～0.284mg/（g.h），過氧化氫酶活性為1.5～3.2mLKMnO4/g·min;各根際土壤樣點磷酸酶活性大小在0.085～0.418mg/（g·h），各樣點間酶活大小規(guī)律按照S6>S5>S3>S1>S4>S2>S1a依次遞減;土壤FDA酶活性大小規(guī)律按照S4>S1>S1a>S3>S2>S6>S5依次遞減，在0.86～8.23μg/g·20min。

蔗糖酶活性與土壤中的腐殖質和有機質等因素呈正相關，過氧化氫酶是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%，且?guī)缀趺恳环N生物體中都含有這一物質。這可能是兩者之間酶活性規(guī)律完全相同的原因之一，而且更為重要的是其總氮含量有機質的變化特點基本保持一致。其他3組則未形成如此顯現的變化規(guī)律，客觀上來說這與處于相介質的土壤及其整個復雜的微環(huán)境均有一定的關系。除了與上述土壤理化性質有著緊密的聯系之外，一般認為其還受到氧化還原電位和pH值等一系列其他因素的影響。

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（責編：張宏民）