木犀草素銅配合物的抗氧化活性與配位模式研究

臧昕 王家文 周坤鵬 厲詩嫻 林瑋 李婧

摘 要：黃酮類金屬配合物具有多種生物和藥理活性。通過木犀草素及其銅配合物與DPPH·、·OH、O2·-作用，探討木犀草素及其銅配合物的抗氧化活性。結(jié)果顯示，銅配合物較木犀草素對·OH的清除能力減弱較為明顯，對DPPH·、O2·-的清除能力下降不明顯。這進(jìn)一步驗(yàn)證了木犀草素以4-C=O和5-OH與銅離子配位，配位模式與抗氧化活性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：木犀草素;銅配合物;抗氧化活性;配位模式

中圖分類號 O657.3;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）10-0018-03

Study of Antioxidant Activity and Coordination Mode of Luteolin Copper Complex

ZANG Xin et al.

（Heilongjiang Bayi Agricultural University， College of Life Science and Biotechnology， Daqing 163319，China）

Abstract： Flavonoid metal complexes have many biological and pharmacological activities. In this research， luteolin and its copper coordination complex were studied antioxidant activity by examining the free radical scavenging effects through reactions with DPPH·， ·OH and O2·-. The results showed that radical scavenging ability of luteolin copper complex on ·OH was weakened obviously compared with luteolin， while the activities on DPPH· and O2·- were slightly lower than that of luteolin. The experiments confirm that luteolin is coordinated with copper ion via 4-C=O and 5-OH， the coordination mode is highly related to the antioxidant activity.

Key words： Luteolin; Copper complex; Antioxidant activity; Coordination mode

木犀草素（luteolin）是具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的典型黃酮類化合物，多存在于木犀草、金銀花、菊花、荊芥等草本植物中，不僅具備抑制腫瘤生長、減少激素分泌、抗菌、抗過敏、抗病毒的生物活性，也可顯著抑制TNF-α（腫瘤壞死因子）和IL-6（白細(xì)胞介素），同時(shí)促進(jìn)炎癥細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)，使氧化應(yīng)激狀態(tài)維持較低水平，從而發(fā)揮抗氧化作用[1-3]。由于木犀草素的3′、4′、5和7位上均含有羥基，因此將其作為配體與金屬離子絡(luò)合形成配合物，所得配合物在裂解DNA、殺滅癌細(xì)胞、清除自由基等生物活性方面均有一定的改善作用[4]。 木犀草素可以與Fe3+、Mn2+、Cr3+、Zn2+、Ca2+等多種金屬元素進(jìn)行配合[5-6]，木犀草素中4-C=O和5-OH、3′-OH和4′-OH可以分別與金屬離子配位形成配合物。關(guān)于配位化合物結(jié)構(gòu)的分析，目前多從紅外、紫外、元素分析等表征中推斷木犀草素與金屬離子的配位形式。為此，筆者應(yīng)用木犀草素與新戊酸銅或苯甲酸銅制備木犀草素銅配合物，分析論證配合物的結(jié)構(gòu)（圖1）[7]。為研究木犀草素銅配合物的抗氧化能力及其與配位模式的關(guān)系，應(yīng)用木犀草素及其銅配合物與DPPH·、

·OH、O2·-等3種自由基在不同濃度下相互作用，通過紫外可見光譜分析對自由基的清除效果，對比抗氧化能力，結(jié)合木犀草素羥基對自由基的活性能力，闡明抗氧化能力與配位模式的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 木犀草素（上海賢鼎公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·，上海阿拉丁試劑），30%H2O2（麥克林公司），其他試劑、藥品均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法 紫外吸收光譜由Thermo Fisher Scientific分光光度計(jì)測得;紅外光譜在Nicolet 380型紅外光譜儀上通過KBr壓片法測得;元素分析在Vario Micro cube上測得。參照課題組前期文獻(xiàn)[7]，將4mmol的木犀草素完全溶解于5mL無水乙醇中，滴加2mmol新戊酸銅的乙醇（5mL）溶液，充分混合并于85℃恒溫水浴中回流反應(yīng)75min，過濾后自然晾干，得到黑色固體，即木犀草素銅配合物。

1.3 自由基清除率測定

1.3.1 DPPH· 稱取0.0039g DPPH·固體，于1mL無水乙醇中充分溶解，從中取0.1mL加入到19.9mL無水乙醇中混勻，制得0.5μmol/mL DPPH·溶液，避光保存;稱取0.0014g木犀草素粉末，加入20mL無水乙醇混合均勻，制成0.5μmol/mL淡黃色溶液;稱取0.0064g銅配合物，以20mL DMSO為溶劑制成0.5μmol/mL橙黃色溶液。將上述溶液均按梯度稀釋為2.5×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.13×10-2、1.56×10-2、7.81×10-3、3.91×10-3、1.95×10-3和9.77×10-4μmol/mL共10個(gè)濃度。在EP管中加入1mL DPPH·溶液，再加入1mL樣品溶液，震蕩均勻后于室溫條件下避光反應(yīng)35min，隨后取出，以無水乙醇為背景，在517nm處測其紫外吸光度A1;將樣品溶液替換為樣液所用溶劑，重復(fù)上述反應(yīng)，記錄紫外吸光度A0;將DPPH·替換為無水乙醇，仍加入1mL樣品溶液，重復(fù)上述反應(yīng)，并記錄紫外吸光度A2，以除去計(jì)算時(shí)樣品溶劑的影響。

DPPH·清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100

1.3.2 ·OH 稱取0.0139g的FeSO4·7H2O，加蒸餾水定容至50mL，制成1μmol/mL FeSO4溶液;取3.3mL30% H2O2溶液，加蒸餾水定容至50mL，制成2μmol/mL H2 O2溶液;取0.0116g的水楊酸固體粉末，加入14mL無水乙醇混勻，制成6μmol/mL水楊酸溶液;木犀草素、配合物按照上述配置并稀釋。在EP管中加入1mL FeSO4溶液和1mL H2O2溶液，再加入2mL樣品溶液，混合均勻，于37℃恒溫水浴中反應(yīng)20min，取出，再加入1mL水楊酸，震蕩均勻，繼續(xù)水浴反應(yīng)20min，以蒸餾水為背景，在520nm處測其紫外吸光度A1;將樣品溶液替換為溶劑，重復(fù)上述反應(yīng)，記錄紫外吸光度A0。

·OH清除率（%）=（A1-A0）/A0×100

1.3.3 超氧陰離子（O2·-） 稱取0.6057g Tris-base固體，加蒸餾水定容至50mL，制成0.1mmol/mL Tris溶液;稱取0.0063g鄰苯三酚固體，用0.01mmol/mL HCl溶液溶解，并定容至100mL，制成0.5μmol/mL鄰苯三酚溶液;木犀草素、配合物按照上述配置并稀釋。在EP管中加入1mL鄰苯三酚溶液，再加入0.4mL Tris溶液，混勻后靜置1.5min，加入1mL 樣品溶液，震蕩均勻，反應(yīng)5min后加入0.25mL HCl溶液終止反應(yīng)，記錄吸光度A1;將樣品溶液替換為溶劑，重復(fù)上述反應(yīng)，記錄紫外吸光度A0。

O2·-清除率（%）=（A1-A0）/A0×100

2 結(jié)果與分析

2.1 對DPPH·自由基的清除作用 在對DPPH·清除機(jī)理的研究中，黃酮化合物通過HAT機(jī)理進(jìn)行反應(yīng)。DPPH·的無水乙醇溶液呈深紫色，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，其含有孤電子的2-N奪取木犀草素羥基上的氫原子，破壞共軛結(jié)構(gòu)，使得溶液逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈S色，其中木犀草素的羥基對自由基的活性順序?yàn)?′-OH>3′-OH>5-OH>7-OH，4′-OH的活性最強(qiáng)[8]。木犀草素及其配合物對DPPH·的清除能力如圖2所示。由圖2可知，隨著樣品濃度增大，清除率增大。在濃度為9.8×10-4μmol/mL和1.95×10-3μmol/mL時(shí)，其對DPPH·的清除率均在10%以下;隨著濃度增長至5×10-1μmol/mL，清除率達(dá)到最高，分別為89.43%和83.61%;配合物的清除能力整體上較木犀草素有小幅降低。這表明銅離子發(fā)生配位后，3′-OH、4′-OH不能參與配位，這2個(gè)羥基與自由基反應(yīng)能力較強(qiáng)，若它們參與了銅離子的絡(luò)合，清除率將會出現(xiàn)較大程度的下降;同時(shí)也表明銅配位后不利于斷裂O-H鍵與半醌式自由基形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致清除能力的略微下降。由此可見，配合物結(jié)構(gòu)中4-C=O和5-OH參與配位，3′-OH、4′-OH未參與配位。

2.2 對·OH的清除作用 FeSO4溶液與H2O2混合后產(chǎn)生·OH，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，游離的·OH與配合物結(jié)合，溶液逐漸變?yōu)樯钭厣?，接著在此溶液中加入水楊酸，與剩余的·OH相互作用，產(chǎn)生2，3-羥基苯甲酸，使得溶液呈淺紫色[9]。木犀草素及其銅配合物對·OH的清除作用如圖3所示。由圖3可知，樣品溶液濃度為9.8×10-4μmol/mL時(shí)，沒有清除能力;之后隨著濃度的提升，木犀草素及其銅配合物對羥基自由基的清除率不斷增大，但配合物的清除作用增長相對緩慢;木犀草素自2.5×10-1μmol/mL后可完全清除自由基，而配合物在5×10-1μmol/mL時(shí)清除效果僅有61.5%。由此可見，配合物對·OH的清除作用較木犀草素降低較多，這可能是由于配位后Cu2+的存在使配合物中羥基提供氫離子的能力下降，從而導(dǎo)致其清除羥基自由基的能力減弱。

2.3 對超氧陰離子（O2·-）的清除作用 鄰苯三酚溶液中加入Tris溶液，即溶液由弱酸性變?yōu)槿鯄A性后，發(fā)生自氧化產(chǎn)生O2·-，且溶液逐漸變?yōu)辄S棕色，在加入樣品溶液后，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，配合物與超氧陰離子結(jié)合，同時(shí)溶液轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣玔10]。在對超氧陰離子的淬滅能力中，黃酮類各環(huán)上的羥基活性相差較大[11]：B環(huán)上含有的酚羥基活性最高;A環(huán)上含有酚羥基活性最弱;若C環(huán)上不飽和雙鍵鏈有羥基，則C環(huán)也具有較強(qiáng)的抗氧化活性。木犀草素C環(huán)上不含有羥基，因此淬滅能力只由B環(huán)和A環(huán)上羥基決定完成。由圖4可知，木犀草素及其銅配合物對超氧陰離子的淬滅能力相當(dāng)。當(dāng)濃度為9.8×10-4μmol/mL時(shí)，兩者均沒有清除效果;隨著濃度的增大，兩者對超氧陰離子自由基的清除率逐漸升高，當(dāng)濃度為1.25×10-1μmol/mL時(shí)，木犀草素及其銅配合物清除率分別達(dá)到95.41%和97%，且兩者均可在5×10-1μmol/mL的濃度下完全清除O2·-。由此可見，配合物的清除能力基本不受Cu2+的影響，這也證實(shí)配合物中Cu2+的配位位點(diǎn)為4-C=O和5-OH，而3′-OH和4′-OH未參與配位。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，對DPPH·的清除中，木犀草素銅配合物能力輕微降低;對·OH的清除中，配合物的能力下降較大;對O2·-的清除中，兩者能力相當(dāng)。對比3種自由基化合物，超氧自由基氧化能力較強(qiáng)，反應(yīng)較快，黃酮上羥基所具有的不同活性能決定物質(zhì)的抗氧化能力;·OH氧化能力稍弱，反應(yīng)較慢，但其位阻較小，木犀草素分子內(nèi)羥基位置影響較小，但羥基的個(gè)數(shù)及分子的還原態(tài)對·OH的影響較大;DPPH·的氧化能力也稍弱，分子結(jié)構(gòu)較大，位阻較·OH大，在奪取黃酮上自由基的過程中，活性較強(qiáng)的羥基位點(diǎn)對DPPH·的清除起著重要作用。結(jié)合抗氧化能力與分子結(jié)構(gòu)分析，本研究進(jìn)一步證明木犀草素4-C=O和5-OH與銅離子配位，也為黃酮類化合物金屬配合物的抗氧化活性研究及對配位結(jié)構(gòu)研究提供了參考。

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（責(zé)編：徐世紅）