基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)三葉湯治療病毒性肺炎作用機(jī)制探討

謝嘉嘉，張立

深圳市寶安中醫(yī)院，廣東 深圳 518100

病毒性肺炎是由上呼吸道出現(xiàn)病毒感染，病原體向下發(fā)展所致的肺部炎癥，主要特征是干咳、咳痰、發(fā)熱、氣喘、肺部濕性啰音等。致病菌包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、巨細(xì)胞病毒等，最為常見的是呼吸道合胞病毒［1］。

病毒性肺炎在中醫(yī)學(xué)上屬于“風(fēng)溫肺熱”“疫病”“肺炎咳嗽”之類，其病機(jī)為邪熱郁于肺，病位在肺，主要癥狀為咳、痰、熱、喘［2］。若身體虧虛，正衰邪盛，易出現(xiàn)邪毒內(nèi)陷、復(fù)感他邪、正氣虛衰等［3］，故病情變化甚快，需要盡早干預(yù)。2019年的新型冠狀病毒肺炎，同樣是病毒性肺炎的一種，其感染病原體是β屬冠狀病毒，主要經(jīng)呼吸道飛沫、氣溶膠或密切接觸傳播，臨床表現(xiàn)是發(fā)熱、干咳、乏力等，發(fā)病早期會(huì)出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)正常或減少，淋巴細(xì)胞數(shù)正常或減少；新型冠狀病毒核酸檢測(cè)陽性或特異性抗體異常；胸部影像學(xué)出現(xiàn)以肺外帶為主的多發(fā)斑片影或間質(zhì)改變。新型冠狀病毒肺炎屬中醫(yī)“疫病”相關(guān)范疇，即感受了“疫戾”之氣發(fā)而為病，此次疫情中醫(yī)藥發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［4］。中醫(yī)藥是以整體觀念為本，通過辨證論治，針對(duì)具體病情調(diào)整用藥，治療疾病時(shí)具有顯著的特色、療效及優(yōu)勢(shì)［5］。

經(jīng)嶺南各代醫(yī)家在止嗽散的基礎(chǔ)上辨證加減而擬方的三葉湯［6］，主要遵循“疏風(fēng)清熱、潤(rùn)肺止咳”的治法，本研究的三葉湯是由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院劉小虹教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行藥物加減而成，共12味中藥，人參葉、龍脷葉、枇杷葉、浙貝母、苦杏仁、桔梗、牛蒡子、防風(fēng)、木蝴蝶、甘草、紫菀、款冬花。方中以人參葉、龍脷葉、枇杷葉三藥共用為君，人參葉性寒，味苦、甘，歸肺、胃經(jīng)，可祛暑生津、補(bǔ)氣益肺；枇杷葉，性味苦、微辛微寒，入肺、胃經(jīng)，可清肺止咳、和胃降逆；龍脷葉是嶺南的道地藥材，性平，味甘、淡，歸肺、胃經(jīng)，可潤(rùn)肺止咳、通便；三者均可入肺經(jīng)，清潤(rùn)上焦肺氣?？嘈尤?，苦降，止咳化痰、降逆平喘，為臣藥；桔梗，辛散，開宣肺氣，同杏仁合用，使肺得以宣降，故能止咳；防風(fēng)為風(fēng)中之潤(rùn)藥，辛能散肝，香能舒脾，風(fēng)能勝濕，走表而散風(fēng)御邪；浙貝母，化痰止咳、清熱散結(jié)，助杏仁止咳化痰；木蝴蝶，可清肺利咽和胃、疏肝。紫菀，苦、辛、甘、微溫，歸肺經(jīng)，潤(rùn)肺化痰止咳；款冬花，化痰降氣平喘，與紫菀相須為用，紫菀善于化痰，款冬花善于止咳，兩者常配伍用。牛蒡子，辛涼，解毒利咽、疏散風(fēng)熱、清利頭目；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏疏風(fēng)宣肺、潤(rùn)肺止咳之功效，且在長(zhǎng)期實(shí)踐中證實(shí)該方有止嗽的療效，被證實(shí)可用于治療鼻后滴流綜合征之慢性咳嗽、上氣道咳嗽綜合征、感染后咳嗽、咳嗽變異性哮喘等［7-9］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)基礎(chǔ)，對(duì)生物系統(tǒng)和疾病的網(wǎng)絡(luò)聚類分析，選擇特有的數(shù)據(jù)信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，進(jìn)行綜合分析的新學(xué)科。其基本原理是通過分析有效成分、基因、蛋白質(zhì)、信號(hào)通路，建立網(wǎng)絡(luò)模型及數(shù)據(jù)可視化，系統(tǒng)地展示中藥、方劑藥理作用及機(jī)制［10］。目前已被廣泛應(yīng)用于中藥的基本藥效、藥效相關(guān)性及中藥復(fù)方作用機(jī)制等［11］，可提高藥物的治療效果，減少藥物不良反應(yīng)，提高新型藥物臨床研究的成功率。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選了三葉湯的活性化合物和作用的靶點(diǎn)，并進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，建立藥物-化合物-靶點(diǎn)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)分析信號(hào)通路，為三葉湯更廣泛地應(yīng)用于治療病毒性肺炎提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 三葉湯所含藥物的化合物收集和篩選應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及Batman-TCM數(shù)據(jù)庫以“人參葉”“枇杷葉”“龍脷葉”“苦杏仁”“浙貝母”“桔?！薄芭］蜃印薄胺里L(fēng)”“木蝴蝶”“紫菀”“甘草”“款冬花”為關(guān)鍵詞進(jìn)行分析，檢索三葉湯中各藥物的化合物成分。根據(jù)毒藥動(dòng)力學(xué)原理，口服生物利用度（oral bioavailability，OB），即制劑中藥物被吸收進(jìn)入人體循環(huán)的速度及程度，該數(shù)值越高表明該藥物的生物活性分子類藥性（durg-likeness，DL）則越好［12］。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，借助TCMSP平臺(tái)，以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為基準(zhǔn)，檢索人參葉、枇杷葉、龍脷葉、苦杏仁、浙貝母、桔梗、牛蒡子、防風(fēng)、木蝴蝶、甘草、紫菀、款冬花所含化合物，篩選出符合標(biāo)準(zhǔn)的活性成分。

1.2 篩選靶標(biāo)蛋白及構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用TCMSP平臺(tái)，對(duì)三葉湯中篩查出的活性成分進(jìn)行檢索，查找與之對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白，使用Unpirot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）查詢靶標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的基因，合并重復(fù)的靶點(diǎn)并刪除無對(duì)應(yīng)基因的蛋白。采用Cytoscape 3.7.2軟件分析化合物及建立靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 預(yù)測(cè)三葉湯治療病毒性肺炎的潛在作用靶點(diǎn)使用疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Genecards http：//www.genecards.org/）以“viral pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索和病毒性肺炎相關(guān)聯(lián)的疾病基因。將篩選得到的疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射，從而選取三葉湯在治療病毒性肺炎中的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建及分析PPI網(wǎng)絡(luò)將以上步驟篩選得到的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/），并設(shè)定物種為“Homo Sapiens”，從而獲得蛋白與蛋白之間相互作用關(guān)系圖，保存為TSV格式文件，將文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.2軟件中，使用“network analyzer”功能分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，篩選出核心靶點(diǎn)。

1.5 分析靶點(diǎn)通路為更好地了解所篩選出的三葉湯治療病毒性肺炎的潛在作用靶點(diǎn)基因的功能及在信號(hào)通路中的作用，將靶基因?qū)隖unrich 3.1.3軟件，進(jìn)行GO富集分析。GO富集分析分別選用生物過程（biological processes，BP），細(xì)胞功能（molecular function，MF），細(xì)胞組分（cell composition，CC），依其富集靶點(diǎn)數(shù)目排序，導(dǎo)出前10個(gè)條目的條形圖。最后，把選出的靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），分析KEGG信號(hào)通路富集，通過Omicshare云平臺(tái)（http：//omicshare.com/）的繪圖工具繪制氣泡圖，使數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果

2.1 篩選三葉湯中活性化合物運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索并篩選出三葉湯所含的化合物，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18的基準(zhǔn)，篩得三葉湯共含有活性化合物共239個(gè)，其中9個(gè)來自人參葉，18個(gè)來自枇杷葉，2個(gè)來自龍脷葉，19個(gè)來自苦杏仁，7個(gè)來自浙貝母，7個(gè)來自桔梗，8個(gè)來自牛蒡子，18個(gè)來自防風(fēng)，18個(gè)來自木蝴蝶，92個(gè)來自甘草，19個(gè)來自紫菀，22個(gè)來自款冬花。表1為三葉湯中部分活性化合物的基本信息。

2.2 構(gòu)建及分析藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建三葉湯中藥物-活性化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)共有240個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括1個(gè)疾病名稱節(jié)點(diǎn)、1個(gè)藥物名稱節(jié)點(diǎn)、28個(gè)活性化合物節(jié)點(diǎn)和210個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，共2 886條邊。網(wǎng)絡(luò)中菱形代表病毒性肺炎，三角形代表三葉湯中的藥物，中間的長(zhǎng)方形代表活性化合物，外周的圓形代表靶點(diǎn)基因。網(wǎng)絡(luò)中的每條邊代表藥物所含有的活性化合物、活性化合物與靶點(diǎn)基因之間的相互作用關(guān)系。等級(jí)值及中心度值是衡量節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵性的重要指標(biāo)，故選取等級(jí)值與中心度值較大的節(jié)點(diǎn)，這些節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起到了重要樞紐作用，可能是關(guān)鍵化合物或靶點(diǎn)。分析所得排名前6位的活性化合物為MOL000098-槲皮素、MOL00682-表沒食子兒茶素沒食子酸酯、MOL000006-木樨草素、MOL000422-山奈酚、MOL000173-漢黃芩素、MOL004328-柚皮素，分別能與108、89、46、32、26、25個(gè)靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用。靶點(diǎn)方面，共有7個(gè)能與21個(gè)或21個(gè)以上的化合物相互作用，排名前6位的是CASP3、BCL2、PTGS2、BAX、RELA、JUN，分別能與28、26、24、23、23、23個(gè)活性化合物相互作用。

2.3 三葉湯治療病毒性肺炎潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索共有3263個(gè)病毒性肺炎的潛在靶點(diǎn)。運(yùn)用Omicshare云平臺(tái)繪制Venn圖，將三葉湯活性成分調(diào)控的靶點(diǎn)與病毒性肺炎的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行映射獲取交集，共獲得210個(gè)交叉靶點(diǎn)作為三葉湯治療病毒性肺炎的潛在作用靶點(diǎn)，見圖2。

圖1 藥物-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析PPI網(wǎng)絡(luò)圖中包含210個(gè)節(jié)點(diǎn)，340條邊，見圖3。靶點(diǎn)蛋白平均節(jié)點(diǎn)度值為3.24，其中度值大于4的靶蛋白有30個(gè)，說明三葉湯發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)極可能是這30個(gè)靶蛋白，見圖4。從圖中可看出各個(gè)蛋白互聯(lián)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，排在前5位的分別是STAT3、JUN、AKT1、IL-6、VEGFA，提示這幾個(gè)靶蛋白在三葉湯治療病毒性肺炎中起到重要的作用。

表1 三葉湯中部分活性化合物的基本信息

圖2 三葉湯治療病毒性肺炎潛在靶點(diǎn)Venn圖

圖3 三葉湯“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 靶點(diǎn)GO富集分析和KEGG通路分析將210個(gè)三葉湯治療病毒性肺炎的潛在靶點(diǎn)基因輸入到FunRich 3.1.3軟件中，得到242個(gè)GO富集條目，見圖5，包括23個(gè)BP、58個(gè)MF和161個(gè)CC。BP主要富集在信號(hào)傳導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換途徑、蛋白代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞間通信、新陳代謝、核堿基監(jiān)測(cè)、免疫應(yīng)答、傳輸、細(xì)胞生長(zhǎng)和（或）維持；MF主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、催化活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、金屬肽酶活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞黏附分子活性、轉(zhuǎn)換活性、氧化還原酶活性、受體信號(hào)復(fù)合體支架；CC主要富集在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞外基質(zhì)、外泌體、細(xì)胞液、細(xì)胞外空隙、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體。KEGG通路富集分析篩選得到171條（P＜0.05）信號(hào)通路，主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨細(xì)胞感染通路（Human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤皰疹病毒相關(guān)感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、糖尿病并發(fā)癥的年齡信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、丙型肝炎（Hepatitis C）、乙型肝炎（Hepatitis B）等。選取前20條富集基因通路所繪制的氣泡圖，見圖6，其中Y軸代表通路名稱，X軸代表所占百分比，氣泡面積代表通路富集基因數(shù)。根據(jù)蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的關(guān)系，選取關(guān)鍵通路，建立“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。

圖4 三葉湯治療病毒性肺炎的關(guān)鍵靶蛋白信息

圖5 GO富集功能分析圖

圖6 三葉湯治療病毒性肺炎KEGG通路富集氣泡圖

圖7 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

病毒性肺炎是由病毒感染引起的急性呼吸系統(tǒng)疾病。最常見的可引肺炎的呼吸道病毒有腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒等［13］。病毒性肺炎屬“疫病”范疇，其主要病機(jī)是人體正氣和外感病邪之間的消長(zhǎng)變化，就如“正氣存內(nèi)，邪不可干”的關(guān)系。人的正氣受到先天稟賦與后天臟腑氣血調(diào)養(yǎng)狀態(tài)的影響，當(dāng)人體正氣的某一方有所偏頗，病邪性質(zhì)和正氣偏頗相切合時(shí)易發(fā)?。?4］。嶺南地區(qū)氣候炎熱，久居易陽熱偏盛，熱盛則汗泄而氣陰不足；嶺南常年濕氣彌漫氤氳，濕熱蘊(yùn)結(jié)于內(nèi)可致脾胃失健運(yùn)，出現(xiàn)納呆、腹脹、便秘，故嶺南人常居此地則易致溫病，以暑濕、濕熱為主［15］。三葉湯中龍脷葉為嶺南道地藥材，其歸肺、胃經(jīng)，潤(rùn)肺止咳、通便，常用于肺燥咳嗽。此外在疏風(fēng)清熱的基礎(chǔ)上兼顧濕邪的治療。三葉湯由經(jīng)典名方“止嗽散”加減組成，具有疏風(fēng)清熱、宣肺止咳之功效。文獻(xiàn)報(bào)道通過三葉湯治療肺型感染咳嗽且效果明顯［16］。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法共篩選出三葉湯中239個(gè)化合物，286個(gè)作用靶點(diǎn)，210個(gè)三葉湯治療病毒性肺炎潛在靶點(diǎn)，表明三葉湯治療病毒性肺炎的多成分、多靶點(diǎn)特征。從“藥物-活性化合物-靶點(diǎn)”相互網(wǎng)絡(luò)中篩查出關(guān)鍵活性化合物，根據(jù)中心度值和等級(jí)值排序得出前5名的有效成分為槲皮素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、山奈酚、木樨草素、漢黃芩素。提示槲皮素相互作用的靶點(diǎn)數(shù)共108個(gè)，說明槲皮素發(fā)揮的作用可能最為顯著。槲皮素已被證實(shí)具有抗病毒、祛痰止咳、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等作用［17］。曹念等［18］認(rèn)為表沒食子兒茶素沒食子酸酯可抑制炎癥、脂質(zhì)過氧化，清除氧自由基，從而減輕肺缺血再灌注損傷。沒食子兒茶素沒食子酸酯被證實(shí)可抗流感，主要是通過作用流感病毒血凝素，抑制RNA聚合酶，降低神經(jīng)氨酸酶活性，具有多途徑、多位點(diǎn)抗流感的良效［19］。木樨草素能促進(jìn)IκB-α的表達(dá)，對(duì)急性肺損傷有保護(hù)作用［20］。研究表明，山奈酚可抗病毒、抗菌、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗氧化［21］；漢黃芩素可顯著抑制NF-κB信號(hào)通路，對(duì)急性肺損傷小鼠有保護(hù)作用［22］。

對(duì)三葉湯治療病毒性肺炎PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，共有210個(gè)靶點(diǎn)蛋白，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、STAT3、JUN、AKT1是三葉湯治療病毒性肺炎的主要作用靶點(diǎn)。STAT3是一種能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。急性肺損傷時(shí)，JAKs-STAT3通路會(huì)被激活，而IL-6則能活化STAT3通路，從而保護(hù)肺；此外STAT3通路的激活，對(duì)抗凋亡有一定的作用［23］。JUN基因是禽肉瘤病毒17的轉(zhuǎn)化基因，其編碼的蛋白與病毒蛋白高度相似，能直接與特定的靶DNA序列作用，達(dá)到調(diào)節(jié)基因的作用。研究表明，JUN可參與肺損傷的修復(fù)過程［24］。AKT1是PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，多種疾病如癌癥、糖尿病常伴隨Akt1調(diào)控的紊亂［25］。病毒感染、雙鏈RNA可誘導(dǎo)正常細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞增殖分化，改善其功能。肺組織損傷時(shí)IL-6會(huì)參與到T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，參與肺部損傷、免疫損傷過程［26］。

從三葉湯治療病毒性肺炎的靶點(diǎn)GO富集分析可看出，其生物過程主要涉及細(xì)胞間通信、細(xì)胞凋亡、新陳代謝、蛋白代謝、免疫應(yīng)答等，這些生物過程在三葉湯治療病毒性肺炎中起到了較為關(guān)鍵的作用。KEGG通路富集分析篩選得到171條信號(hào)通路，主要涉及PI3K-Akt、甲型流感病毒、人巨細(xì)胞感染通路、卡波西肉瘤皰疹病毒相關(guān)感染、EB病毒（epsteinBarr virus，EBV）、麻疹病毒、腫瘤壞死因子、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等。研究證明，PI3K-Akt是病毒的一個(gè)重要靶標(biāo)，該信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄翻譯、細(xì)胞凋亡等進(jìn)程有著密切的聯(lián)系，諸如埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、流感病毒、人巨細(xì)胞病毒、柯薩奇病毒的感染，可通過阻斷PI3K-Akt信號(hào)通路，達(dá)到抑制病毒之作用［27］。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法證實(shí)三葉湯治療病毒性肺炎的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，可為三葉湯的拓展臨床應(yīng)用提供一定可靠的藥物理論依據(jù)。但本研究仍有一定的局限性，如中藥方劑的服用需要結(jié)合患者的臨床癥狀進(jìn)行具體辨證論治，由于數(shù)據(jù)庫查詢相關(guān)數(shù)據(jù)不全，可能會(huì)忽略中藥成分含量、藥物與成分間相互作用、體內(nèi)其他藥代動(dòng)力學(xué)的影響等因素，其具體藥理機(jī)制還需要得到更深入的科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)證明。