基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討丹參治療妊娠期高血壓的作用機(jī)制*

曹煥澤，胡亦然，任玲，蔡平平

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250000

妊娠期高血壓（hypertensive disorders of pregnancy，HDP）是以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)的妊娠期特發(fā)疾病，嚴(yán)重者伴發(fā)多臟器損傷，甚至導(dǎo)致死亡［1］。HDP是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和新生兒死亡的主要原因之一，死亡率占全球孕婦總死亡率的14%，與正常孕產(chǎn)婦相比，妊娠期高血壓患者心、腦血管等遠(yuǎn)期并發(fā)癥發(fā)生率有所增加［2-3］。近年來(lái)常在基礎(chǔ)治療的基礎(chǔ)上聯(lián)合中藥注射液治療妊娠期高血壓的臨床對(duì)照研究，選用的中藥注射液以丹參制劑——丹參注射液與復(fù)方丹參注射液最為常見(jiàn)，并且有較好的治療效果。丹參，是婦科常用藥之一，有“女科要藥”之稱(chēng)，其最早記載見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，早在北宋時(shí)期已有丹參用于“妊娠中風(fēng)”的記載。藥理研究表明，丹參具有抗腫瘤、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗炎、抗氧化、抗抑郁、改善糖代謝等作用［4-5］。但是丹參活性成分多，作用靶點(diǎn)繁雜，其在妊娠期高血壓治療中的機(jī)制仍待進(jìn)一步明確。

本文從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為角度，探討丹參治療妊娠期高血壓的有效成分以潛在作用靶點(diǎn)，并探索其可能的作用機(jī)制，為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 丹參主要活性成分及潛在作用靶點(diǎn)篩選基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP），以“丹參”（danshen）為關(guān)鍵詞，生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件檢索，獲得丹參主要活性成分及作用靶點(diǎn)。

1.2 妊娠期高血壓的相關(guān)靶基因檢索應(yīng)用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以“hypertensive disorders of pregnancy”為關(guān)鍵詞檢索，獲取HDP的所有相關(guān)基因，保留Score≥10的結(jié)果。同時(shí)在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）中，以“hypertensive disorders of pregnancy”為關(guān)鍵詞檢索，獲取相關(guān)基因。將兩數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的基因進(jìn)行合并、去重以及規(guī)范基因名稱(chēng)等處理。

1.3 構(gòu)建“疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖將丹參主要活性成分的靶基因與妊娠期高血壓相關(guān)靶基因進(jìn)行映射，利用韋恩圖（Venn）將兩者取交集，得到丹參-妊娠期高血壓的藥物-疾病交集基因。將交集基因及丹參主要活性成分定義為網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)，藥物、疾病、藥物——疾病交集靶點(diǎn)基因以及藥物活性成分間相互作用關(guān)系定義為網(wǎng)絡(luò)圖的連接，運(yùn)用Cytoscape軟件，構(gòu)建丹參治療HDP的“疾病-藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建將藥物-疾病交集靶點(diǎn)基因，作為“Ptotein Name”輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），物種設(shè)定為“Homo sapiens”，結(jié)合分?jǐn)?shù)設(shè)定為＞0.4，忽略孤立節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建丹參-妊娠期高血壓的靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO生物過(guò)程及KEGG信號(hào)通路分析采用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)，將藥物-疾病交集基因名稱(chēng)轉(zhuǎn)化Uniprot ID。運(yùn)用Bioconductor數(shù)據(jù)工具平臺(tái)（http：//www.bioconductor.org/）與Rx64（3.6.3）軟件，分析靶點(diǎn)的GO富集和KEGG信號(hào)通路，并將所得結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 丹參主要活性成分與相關(guān)分子靶基因通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“丹參”，檢索到202種化合物。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，得到丹參主要活性成分65種，對(duì)應(yīng)靶基因108個(gè)。

2.2 妊娠期高血壓相關(guān)基因以“hypertensive disorders of pregnancy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，于Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取HDP相關(guān)基因4706種，設(shè)定相關(guān)度≥10%為篩選條件，二次篩選后收集到基因1 573個(gè)；于OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到HDP相關(guān)基因735個(gè)。將兩數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的相關(guān)基因匯總、刪除重復(fù)基因，共1 945個(gè)HPD相關(guān)基因，作為疾病靶基因。

2.3 “疾病-藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)將丹參對(duì)應(yīng)的108個(gè)靶點(diǎn)基因與1945個(gè)疾病靶基因進(jìn)行映射，通過(guò)Venn圖分析得到丹參-HDP相交靶基因共73個(gè)。將節(jié)點(diǎn)及節(jié)點(diǎn)間相互作用的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape軟件，得到丹參治療HDP的“疾病-藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1，其中靶點(diǎn)基因中PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、ADRA1A、ACHE度值較高，丹參活性成分中度值較高的為luteolin、tanshinone iia、4-methylenemiltirone、salviolone、dihydrotanshinlactone。

圖1 “疾病-藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）將73個(gè)丹參-HDP交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，見(jiàn)圖2，PPI網(wǎng)絡(luò)中蛋白節(jié)點(diǎn)73個(gè)，764條相互作用線(xiàn)，平均節(jié)點(diǎn)度20.9，平均局部聚類(lèi)系數(shù)為0.7。根據(jù)PPI中基因之間連接節(jié)點(diǎn)數(shù)目，統(tǒng)計(jì)出連接節(jié)點(diǎn)最多的30個(gè)核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。其中AKT激酶（AKT1）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）為連接節(jié)點(diǎn)最多的4個(gè)靶點(diǎn)，連接節(jié)點(diǎn)數(shù)目分別為43、40、39、38個(gè)。

圖2 藥物-疾病靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 藥物-疾病核心靶點(diǎn)

2.5 GO富集功能分析GO富集分析獲得109個(gè)生物過(guò)程，排名前10的分子功能（molecular function，MF）、生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC），見(jiàn)圖4。MF以?xún)翰璺影?、磷酸酶、?lèi)固醇、細(xì)胞因子受體結(jié)合及G蛋白偶聯(lián)胺受體、腎上腺素能受體、核受體、轉(zhuǎn)錄因子、類(lèi)固醇激素受體活化為主；血管的大小、管徑、收縮及循環(huán)系統(tǒng)中血管的調(diào)節(jié)，對(duì)類(lèi)固醇激素、抗生素、異生物質(zhì)、金屬離子的應(yīng)激反應(yīng)、肌細(xì)胞增殖、腺體發(fā)育是主要BP。CC相關(guān)度高的為細(xì)胞膜、膜質(zhì)微區(qū)、膜區(qū)域，突觸前膜、突觸后膜、突觸膜的組成部分及固有成分等。

圖4 GO富集功能分析

2.6 KEGG通路富集分析KEGG通路富集到44條相關(guān)通路，篩選出富集程度最高的20條通路，見(jiàn)圖5。其中信號(hào)傳導(dǎo)通路在相關(guān)通路中占據(jù)較大比重，涉及PI3K/AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、FOxO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等。其中PI3K/AKT信號(hào)通路，見(jiàn)圖6，涉及CHRM2、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、CDKN1A、CASP9、MAPK1、IL6、MDM2、ERBB2、IL2、IL4、INSR、MET、BCL2、MYC、ITGB3等18個(gè)相關(guān)基因，基因富集程度最高。

圖5 KEGG富集程度最高的20條通路

圖6 PI3K/AKT信號(hào)通路

3 討論

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)丹參治療妊娠期高血壓的相關(guān)活性成分、作用靶點(diǎn)以及途徑進(jìn)行分析。丹參活性成分多，經(jīng)過(guò)篩選后，生物利用度與類(lèi)藥性較高的丹參活性成分達(dá)65種，丹參酮、隱丹參酮、木犀草素、4-亞甲基硝胺以及二氫丹參內(nèi)酯度值較高，可能在治療妊娠期高血壓中發(fā)揮更關(guān)鍵作用。

丹參治療HDP潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，AKT激酶（AKT1）、IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等靶點(diǎn)相互作用蛋白眾多，可能為關(guān)鍵靶點(diǎn)。AKT作為多種信號(hào)通路的中心節(jié)點(diǎn)，參與代謝，細(xì)胞增殖、存活、生長(zhǎng)，血管生成的調(diào)節(jié)等過(guò)程的信號(hào)傳導(dǎo)［6］。VEGF具有血管擴(kuò)張的作用，可誘導(dǎo)一氧化氮的產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)節(jié)血管活性功能和血管生成反應(yīng)，參與胎盤(pán)發(fā)育和功能所需的新血管的形成［7］。胎盤(pán)受損的螺旋動(dòng)脈重塑導(dǎo)致抗血管生成因子釋放，誘發(fā)母體血管內(nèi)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致妊娠期出現(xiàn)高血壓和蛋白尿［8］。IL-6可與體內(nèi)其他炎性因子相互作用，令血管收縮與血壓升高，導(dǎo)致子癇等一系列的臨床表現(xiàn)［9］。MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，參與內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)和炎性因子表達(dá)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示了與血管及內(nèi)皮生成、炎癥反應(yīng)相關(guān)的一系列靶點(diǎn)，如表皮生長(zhǎng)因子受體PP1、NOS2、IL10、IL4、IL2、IFNG、CD40配體等；與細(xì)胞凋亡及離子通道調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白，如Bcl-2、E3泛素蛋白連接酶等。

靶點(diǎn)的富集分析顯示丹參治療HDP的作用涉及多個(gè)生物過(guò)程及信號(hào)通路，如PI3K/AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體、FOxO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等。胎盤(pán)螺旋小動(dòng)脈重鑄不足、胎盤(pán)持續(xù)缺氧是先兆子癇發(fā)病機(jī)制之一，低氧胎盤(pán)釋放出抗血管生成和促炎因子，引起母體血管內(nèi)皮功能障礙、高血壓和器官損傷［10］。PI3K/AKT信號(hào)通路存在廣泛，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化與遷移的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)sFlt-1等血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子拮抗劑蛋白的激活，調(diào)節(jié)血管生成因子的血漿水平與血管介質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲，維持胎盤(pán)功能；同時(shí)可激活下游eNOS，促進(jìn)NO釋放，調(diào)控血管舒張，增加胎盤(pán)血供［11-13］。曹慧敏等［14］發(fā)現(xiàn)，丹參酮II A通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。缺氧誘導(dǎo)因子信號(hào)通路（HIF-1信號(hào)通路）參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)激活下游相關(guān)靶點(diǎn)減輕耗氧量，并調(diào)控Bac-2以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）是HIF-1信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，在機(jī)體處于低氧狀態(tài)時(shí)激活HIF-1信號(hào)通路參與氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體各組織功能，減輕耗氧量，適應(yīng)缺氧狀態(tài)［15］。HIF-1信號(hào)通路過(guò)度活化，胎盤(pán)對(duì)氧敏感性增加，滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力下降，是導(dǎo)致妊娠期高血壓的機(jī)制之一［16］。JAK/STAT信號(hào)通路可作用于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化及免疫等，與內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)，抑制此通路可改善血管內(nèi)皮的分泌功能以及eNOS高表達(dá)，阻止子癇前期的重要危險(xiǎn)因素sFlt-1的產(chǎn)生［17-18］。表皮生長(zhǎng)因子通路（EGF信號(hào)通路）調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化，其破壞可能導(dǎo)致發(fā)生妊娠期高血壓［19］。炎性過(guò)程與妊娠期高血壓的發(fā)病相關(guān)，患有妊娠并發(fā)癥的婦女血清中TNF-α，IL-6，IL-10等炎性因子升高［20-21］。TNF信號(hào)通路可調(diào)控IL-6與NF-κB表達(dá)，調(diào)節(jié)eNOS，控制血管炎癥，同時(shí)可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善胎盤(pán)血管循環(huán)障礙［22-23］。FOXO是絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT（也稱(chēng)為蛋白激酶B）的主要底物，PI3K/Akt途徑的激活拮抗FOXO活性，又能夠擴(kuò)增信號(hào)傳導(dǎo)［24］。

綜上所述，本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)丹參在治療妊娠期高血壓中潛在作用機(jī)制進(jìn)行探究，認(rèn)為丹參治療妊娠期高血壓的相關(guān)靶點(diǎn)多集中在AKAKT1、IL-6、VEGFA、MAPK1等靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體、FOxO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等多條通路，影響胎盤(pán)螺旋動(dòng)脈收縮、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)僅是單純從化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路方面進(jìn)行的理論篩選，后續(xù)仍需更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行支持以及驗(yàn)證。