右美托咪定聯(lián)合鹽酸艾司洛爾對(duì)肺癌根治術(shù)病人肺保護(hù)作用及其對(duì) Toll 樣受體 4/核因子-κB 信號(hào)通路的影響

武長君，錢鵬

作者單位：攀枝花市第二人民醫(yī)院麻醉科，四川 攀枝花 617068

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，目前臨床主要采用手術(shù)方式治療肺癌，全身麻醉聯(lián)合雙腔支氣管插管單肺通氣可引起機(jī)體免疫反應(yīng)從而促使炎性因子分泌最終引起肺部炎癥反應(yīng)，這對(duì)肺組織造成一定損傷。全身麻醉時(shí)采用的一些麻醉藥物可在一定程度上減輕炎癥反應(yīng)從而保護(hù)肺功能。右美托咪定屬于鎮(zhèn)靜藥物，研究表明右美托咪定可有效抑制炎性介質(zhì)的釋放并可抑制炎癥反應(yīng)從而減輕肺組織炎癥損傷。鹽酸艾司洛爾屬于高選擇性 β1 受體阻滯劑，作為圍手術(shù)期用藥，鹽酸艾司洛爾可有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而保護(hù)腎臟組織。但右美托咪定與鹽酸艾司洛爾聯(lián)合使用對(duì)肺癌根治術(shù)病人肺功能的作用尚未可知。Toll 樣受體 4∕核因 子 - κB（Toll-like receptor 4∕nuclear factor- κB p65，TLR4∕NF-κB p65）是一種炎癥信號(hào)通路，研究表明抑制 TLR4∕NF-κB 信號(hào)通路激活可有效降低炎癥反應(yīng)程度，并可改善病人心功能。本研究主要探討右美托咪定聯(lián)合鹽酸艾司洛爾對(duì)肺癌根治術(shù)病人肺功能的影響，旨在為肺癌根治術(shù)病人病情與肺功能的評(píng)估及改善肺功能提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析 2017年 10月至 2018年 12月攀枝花市第二人民醫(yī)院收治的擇期行肺癌根治術(shù)的肺癌病人臨床資料，選取 40例麻醉誘導(dǎo)前加用鹽酸艾司洛爾的病人為聯(lián)合組，按成組比較法1∶1 比例選擇同期采用常規(guī)麻醉誘導(dǎo)的 40例病人為對(duì)照組 。對(duì)照組中男 22例，女 18例，年齡（63.24±8.16）歲 ，范圍為 54～72歲 ；聯(lián)合 組 中男 25例，女 15例，年齡（65.21±7.20）歲，范圍為 57～73歲。兩組病人性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P＞

0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病人經(jīng)影像學(xué)檢查與病理檢查確診為肺癌；無手術(shù)禁忌證；預(yù)計(jì)切除范圍不超過 1 個(gè)肺葉；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤病人；腦、肺功能嚴(yán)重?fù)p傷者。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人或其近親屬知情且簽署同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 Trizol 試劑購自美國 Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量 PCR 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛、髓過氧化物（myeloperoxidase，MPO）、黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）ELISA 檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。ABI 7500 型熒光定量 PCR 儀購自華科鑒聯(lián)基因科技（北京）有限公司；BIOBASE4000 型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀購自北京希爾恒泰科技有限公司；血生化儀購自濟(jì)南漢方醫(yī)療器械有限公司。

1.2.2 治療方法 對(duì)照組：病人麻醉誘導(dǎo)時(shí)同時(shí)輸注右美托咪定（武漢科斯坦生物科技有限公司，貨號(hào) T2524，規(guī)格 25 mg），1 μg∕kg 負(fù)荷量，時(shí)間 10 min，持續(xù)注射（速度 0.5 μg·kg·h）至術(shù)前 30 min。聯(lián)合組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上應(yīng)用鹽酸艾司洛爾，鹽酸艾司洛爾（齊魯制藥有限公司，貨號(hào) 170215003，規(guī)格 2 mL∕0.2 g）于麻醉誘導(dǎo)前 5 min 以 1 μg∕kg 靜推 2 min，聯(lián)合右美托咪定，1 μg∕kg 負(fù)荷量，時(shí)間 10 min，持續(xù)注射（0.5 μg·kg·h），直至術(shù)前 30 min。

1.2.3 采集樣本 分別于術(shù)前（T1）、開胸后（T2）、單肺通氣 60 min（T3）、手術(shù)結(jié)束時(shí)（T4）采集病人空腹靜脈血 5 mL，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r∕min 離 心 10 min，吸取血清置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。分別于 T2、T3、T4 時(shí)從需切除肺葉旁 5 cm 處（或鄰近肺葉邊緣）楔形切取肺組織少許，深低溫保存。分別于 T1 與T4 時(shí)抽取病人空腹靜脈血 5 mL，采用 Ficoll 密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)（qRTPCR）檢 測 TLR4 mRNA、NF- κB mRNA 的表達(dá)水平采用 Trizol 法提取外周血單核細(xì)胞中總 RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定 RNA 濃度。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddHO 補(bǔ)足體系至 20 μL；反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，4 ℃保存。TLR4 正向引物 5’-ACGGAATTTGCCAAGGAACC-3’，反向引物 5’-GGCATTCCTGAAACCAAGCA-3’；NF-κB 正向引物 5’-AATGGTGGAGTCTGGGA AGG-3’，反向引物 5’-TCTGCGTTTCCTCTGCACT-3’；GAPDH 正向引物 5’-AACGGA TTTGGTCGTATTG-3’，反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR 反應(yīng)體系：互補(bǔ) DNA（cDNA）2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各 1 μL，RNase-Free ddHO 補(bǔ)足體 系 至 20 μL；反應(yīng)條件 ：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s（循環(huán) 40 次）。TLR4、NF-κB以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 2法計(jì)算 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 ELISA 檢測血清炎性因子水平 采用 ELISA檢測血清炎性因子 IL-6、IL-8、TNF-α 的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 肺臟組織標(biāo)本采集及檢測 取出凍存肺組織，4 ℃復(fù)溫，研磨肺組織，采用 ELISA 檢測肺組織勻漿上清液中丙二醛、MPO、XOD 的水平。

1.2.7 檢測動(dòng)脈血氧分壓（PaO）、氧合指數(shù)、氣道平臺(tái)壓（APP）、氣道阻力 分別于 T1、T2、T3、T4 時(shí)采集病人橈動(dòng)脈血液，檢測吸入氧分壓 PaO、氧合指數(shù)，檢測病人同一時(shí)間點(diǎn)的肺損傷情況，主要檢測指標(biāo)為氣道平臺(tái)壓、氣道阻力。

1.2.8 檢 測中 性粒 細(xì)胞（PMN）數(shù)量 應(yīng)用 血液 生化分析儀檢測 T1、T2、T3、T4 時(shí)檢測病人 PMN 數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組病人各時(shí)間點(diǎn)炎性因子水平比較

IL-6的 8 個(gè)學(xué)生化殘差均服從正態(tài)分布（

P

＞0.05），因變量不滿足球形假設(shè)（

W

=0.015，

χ

=157.500，

P

＜0.001），采用 Greenhouse-Geisser 進(jìn)行校正（epsilon=0.372），用藥和時(shí)間的交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

F

=110.473，

P

＜0.001；IL-8 和 TNF-α 的 8 個(gè)學(xué)生化殘差均服從正態(tài)分布（

P

＞0.05），因變量滿足球形假設(shè)（

W

=0.624，

χ

=4.927，

P

=0.096；

W

=0.675，

χ

=4.668，

P

=0.124），用藥和時(shí)間的交互作用均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ，

F

=92.571，

P

＜0.001；

F

=104.828，

P

＜0.001。 進(jìn) 一步對(duì)內(nèi)因素單獨(dú)效應(yīng)進(jìn)行分析，兩組在 T2、T3、T4 時(shí)間點(diǎn) IL-6、IL-8、TNF-α 水平均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；時(shí)間因素對(duì)兩組 IL-6、IL-8、TNF-α 的影響均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。兩組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較結(jié)果見表1。

表1 兩組肺癌各時(shí)間點(diǎn)炎性因子水平比較∕（ng∕L）

2.2 兩組病人肺臟組織指標(biāo)比較

丙二醛、MPO、XOD 的 6 個(gè)學(xué)生化殘差均服從正態(tài)分布（

P

＞0.05），因變量均不滿足球形假設(shè)（

W

=0.802，

χ

=8.382，

P

=0.015；

W

=0.739，

χ

=10.363，

P

=0.004；

W

=0.744，

χ

=9.843，

P

=0.006），均采用 Greenhouse-Geisser 進(jìn)行校正（epsilon=0.835、0.754、0.772），用藥和時(shí)間的交互作用均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

F

=6 784.606，

P

＜0.001；

F

=6 048.537，

P

＜0.001；

F

=6254.734，

P

＜0.001。 進(jìn) 一 步對(duì)內(nèi)因素單獨(dú)效應(yīng)進(jìn)行分析，兩組在 T2、T3、T4 時(shí)間點(diǎn)丙二醛、MPO、XOD 水平均差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；時(shí)間因素對(duì)兩組丙二醛、MPO、XOD 的影響均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。兩組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較結(jié)果見表2。

表2 兩組肺癌病人肺臟組織指標(biāo)比較∕

2.3 兩組病人 PaO、氧合指數(shù) 、氣道平臺(tái)壓 、氣道阻力比較

PaO、氧合指數(shù)、APP、氣道阻力的 8 個(gè)學(xué)生化殘差均服從正態(tài)分布（

P

＞0.05），因變量均不滿足球形假設(shè)（

W

=0.002，

χ

=227.415；

W

=0.019，

χ

=148.684；

W

=0.024，

χ

=141.670；

W

=0.013，

χ

=164.578。 均

P

＜0.001），均采用 Greenhouse-Geisser進(jìn)行校正（epsilon=0.371、0.381、0.402、0.369），用藥和時(shí)間的交互作用均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

F

=62.769，

P

＜0.001；

F

=68.842，

P

＜0.001；

F

=75.474，

P

＜0.001；

F

=84.231，

P

＜0.001。進(jìn)一步對(duì)內(nèi)因素單獨(dú)效應(yīng)進(jìn)行分析，兩組在 T2、T3、T4 時(shí)間點(diǎn) PaO、氧合指數(shù)、APP、氣道阻力水平均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；時(shí)間因素對(duì)兩組 PaO、氧合指數(shù)、APP、氣道阻力的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。兩組組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)兩兩比較結(jié)果見表3。

表3 兩組肺癌病人動(dòng)脈血氧分壓（PaO2）、氧合指數(shù)、氣道平臺(tái)壓（APP）、氣道阻力比較

2.4 兩組病人各時(shí)間點(diǎn) PMN 數(shù)量及外周血單核細(xì)胞 中 TLR4、NF- κB 表達(dá)量比較

PMN、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA 的 8 個(gè)學(xué)生化殘差均服從正態(tài)分 布（

P

＞0.05），因變量均不滿足球形假設(shè)（

W

=0.067，

χ

=101.967；

W

=0.306，

χ

=44.708；

W

=0.509，

χ

=25.476。 均

P

＜0.001），采 用 Greenhouse-Geisser 進(jìn)行校正（epsilon=0.414、0.602、0.721），用藥和時(shí)間的交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，

F

=678.365，

P

＜0.001；

F

=716.240，

P

＜0.001；

F

=1 449.398，

P

＜0.001。進(jìn)一步對(duì)內(nèi)因素單獨(dú)效應(yīng)進(jìn)行分析，兩組在 T2、T3、T4 時(shí)間點(diǎn)PMN、TLR4 mRNA 水平，T3、T4 時(shí)間點(diǎn) NF-κB mRNA表達(dá)量均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）；時(shí)間因素對(duì)兩 組 PMN、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA 的影 響均 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。兩兩比較結(jié)果見表4。

表4 兩組肺癌病人各時(shí)間點(diǎn) PMN 數(shù)量及外周血單核細(xì)胞中 TLR4、NF-κB 表達(dá)量比較∕

3 討論

肺癌根治手術(shù)過程中部分麻醉藥物也可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不利影響。肺癌根治術(shù)后病人肺功能與腦功能損傷加重。因而如何在肺癌根治術(shù)過程中保護(hù)病人肺功能成為臨床亟待解決的問題。

右美托咪定聯(lián)合鹽酸艾司洛爾可有效抑制交感神經(jīng)活性，并可有效治療交感電風(fēng)暴。研究表明右美托咪定可有效保護(hù)肺癌根治術(shù)病人圍手術(shù)期腦功能、肺功能，并可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。相關(guān)報(bào)道指出鹽酸艾司洛爾可改善急性心肌梗死病人心臟功能，并可降低炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合組 IL-6、IL-8、TNF-α 水平明顯低于對(duì)照組，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似。提示聯(lián)合用藥可降低炎癥因子 IL-6、IL-8、TNF-α 水平從而有效減輕肺組織炎癥反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮肺保護(hù)作用。研究表明氧化應(yīng)激是手術(shù)過程中造成器官損傷的重要原因之一，丙二醛水平升高可促使肺部氧化損傷，XOD 轉(zhuǎn)化為黃嘌呤過程中可產(chǎn)生氧自由基從而損傷組織器官，MPO分泌量增加可促進(jìn)各種氧自由基生成從而損傷機(jī)體組織器官。本研究結(jié)果顯示聯(lián) 合 組丙二醛、MPO、XOD 水平明顯低于對(duì)照組，說明聯(lián)合用藥可通過 降 低丙二醛、MPO、XOD 水平而減輕肺損傷。提示右美托咪定聯(lián)合鹽酸艾司洛爾可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)從而對(duì)肺癌根治術(shù)病人肺組織損傷發(fā)揮保護(hù)作用，且作用效果較為顯著。同時(shí)本研究結(jié)果顯示聯(lián)合組 PaO、氧合指數(shù)明顯高于對(duì)照組，氣道平臺(tái)壓、氣道阻力明顯低于對(duì)照組，其中 PaO、氧合指數(shù) 、氣道平臺(tái)壓 、氣道阻力可有效反應(yīng)肺功能。本研究結(jié)果提示右美托咪定聯(lián)合鹽酸艾司洛爾可有效保護(hù)病人肺功能。研究表明 PMN 數(shù)量增加可促進(jìn) MPO 生成從而促進(jìn)肺部氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合組 PMN 數(shù)量顯著低于對(duì)照組，提示聯(lián)合用藥可有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生從而發(fā)揮肺保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合組病人中 TLR4、NF-κB 的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，提示聯(lián)合用藥可有效抑制 TLR4∕NF-κB 信號(hào)通路激活，可能通過減輕 NF-κB 對(duì)炎性介質(zhì)表達(dá)的調(diào)控作用，以及間接減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮對(duì)全麻過程中肺功能的保護(hù)作用。

綜上所述，右美托咪定聯(lián)合鹽酸艾司洛爾可有效保護(hù)肺癌根治術(shù)病人肺功能，減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，其可能是通過抑制 TLR4∕NF-κB 信號(hào)通路的激活從而發(fā)揮作用。