基質(zhì)金屬蛋白酶-1 mRNA、A-2 巨球蛋白 mRNA 在創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎病人軟骨中的表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性

馮利君，張允帥，王宸

作者單位：開封市中心醫(yī)院骨科，河南 開封 475000

創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（Post-traumatic osteoarthritis，PTOA）主要以關(guān)節(jié)軟骨退化、變性及繼發(fā)性關(guān)節(jié)軟骨增生與硬化為病理特點，可引起關(guān)節(jié)疼痛與功能障礙，嚴(yán)重降低病人生活質(zhì)量?；|(zhì)金屬蛋白酶-1（Matrix metalloproteinase-1，MMP-1）作用底物主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原和蛋白多糖，在大鼠骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）中呈高表達(dá)。A-2 巨球蛋白（A-2 macroglobulin，A2M）是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，在股骨頭壞死者關(guān)節(jié)囊滑膜組織中呈低表達(dá)。 現(xiàn)階段關(guān)于 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 在PTOA病人軟骨中的表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度相關(guān)性的報道較少，是否有助于鑒別 PTOA、RA 仍不明確。本研究對此進(jìn)行探討，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取開封市中心醫(yī)院 2018年 1月至 2019年 6月收治的 PTOA 病人 76例作為PTOA 組 ，另選取同期該院 RA 病人72例作為 RA組。兩組性別、年齡等一般資料均衡可比（

P

＞0.05），見表1。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

表1 兩組創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎病人臨床資料對比

1.2 納排標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn) ：PTOA、RA 分別符合PTOA、RA 診斷標(biāo)準(zhǔn)；以往無 PTOA、RA 手術(shù)治療史；入組前 1 個月無相關(guān)藥物應(yīng)用史；無血液系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并膝關(guān)節(jié)結(jié)核者；合并骨折者；妊娠期、哺乳期病人。

1.3 方法

1.3.1 軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達(dá)的檢測 （1）主要試劑、儀器：Trizol（武漢科昊佳生物科技有限公司）；RNase-free ddHO（上海索寶生物科技）；Prime ScriptRT Enzyme Mix［寶生物（大連）工程有限公司］；5×PrimeScript Buffer［寶生物工程（大連）有限公司］；Nuclease-Free Water（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司）；熒光定量 PCR 儀（美國 ABI-7300）。（2）檢測方法：治療前，均在病人知情同意條件下，采集適量脛骨平臺軟骨組織，液氮保護(hù)下研磨成碎末，加入含有 1 mL Trizol 的 EP 管中，冰上靜置 15 min，加入 0.2 mL 三氯甲烷，充分混勻，室溫放置 5 min，12 000 r∕min 離心 15 min，轉(zhuǎn)移上層水相500 μL 至 新 的 EP 管中，加入等體積的異丙 醇，混勻，室溫靜置 20 min，12 000 r∕min 離心 10 min，上清棄之，可見細(xì)小白色膠狀沉淀。加入 1 mL 預(yù)冷的用RNase-free ddHO 與 100% 乙醇配置的 75% 冰乙醇，8 000 r∕min 離心 5 min，管內(nèi)液體棄之，室溫放置 0.5 h，加入 RNase-free ddHO 20 μL 混勻，分光光度計檢測總 RNA 純度與質(zhì)量。按以下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件 37 ℃ 15 min，95 ℃ 5 s，4 ℃ 60 min，得到互補 DNA（cDNA），采用實時熒光定量PCR 檢測各基因表達(dá)，引物序列、PCR 反應(yīng)體系如下，反應(yīng)條件 95 ℃ 15 min 預(yù)變性，95 ℃ 5 s 變性，55 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 30 s 延伸，溶 解曲 線 95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，循環(huán) 1 次，4 ℃保存，用相對內(nèi)參的表達(dá)量表示各目的基因表達(dá)量。由該院檢驗室統(tǒng)一完成，以上檢驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.2 PTOA 病情評估 采用 X 線 ellgren&Lawrence分級標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級：輕微骨贅；Ⅱ級：明顯骨贅，但未累及關(guān)節(jié)間隙；Ⅲ級：關(guān)節(jié)間隙中度變窄；Ⅳ級：關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，軟骨下骨硬化。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）比較兩組軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達(dá)量。（2）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 鑒別診斷 PTOA、RA 的截斷值、靈敏度、特異度。（3）不同病情病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 膝 關(guān) 節(jié) 評 分 法（Knee society score，KSS）、美國特種 外科醫(yī)院（Hospital for special surgery，HSS）評分：KSS、HSS 評分滿分 100 分，分值與均膝關(guān)節(jié)功能呈正比。（4）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 與 PTOA 病情程度的相關(guān)性。（5）分析 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達(dá)量與 KSS、HSS 評分相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 兩組軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達(dá)量比較

PTOA 組軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA低于RA組（

P

＜0.05），見表2。

表2 兩組關(guān)節(jié)炎病人軟骨中MMP-1 mRNA、A2M mRNA表達(dá)量比較∕

2.2 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 對 PTOA、RA 鑒別診斷價值

ROC 分析顯示，MMP-1 mRNA+A2M mRNA 鑒別診斷 PTOA、RA 的 AUC 為 0.909，大于單一的 MMP-1 mRNA、A2M mRNA，靈敏度為 89.47%，特異度為 80.56%。見表3。

2.3 不同病情病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 KSS、HSS 評分

MMP-1 mRNA、隨病情分級增加呈逐漸升高趨勢 ，A2M mRNA 表 達(dá) 量 、KSS、HSS 評分呈下降趨勢（

P

＜0.05），見表4。

表4 不同創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎病情病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 及 KSS、HSS 評分∕

2.4 MMP-1 mRNA、A2M mRNA與PTOA病情程度的關(guān)系

logistic 回歸分析顯示，MMP-1 mRNA、A2M mRNA 與 PTOA 病情程度顯著相關(guān)（

P

＜0.05），見表5。

2.5 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表達(dá)量與 KSS、HSS 評分相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析 ，MMP-1mRNA 與 KSS、HSS 評分呈負(fù)相關(guān)（

r

= - 0.575、-0.541，均

P

＜0.05），A2M mRNA 表達(dá)量與 KSS、HSS評分呈正相關(guān)（

r

=0.592、0.610，均

P

＜0.05）。

表5 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 與創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎（PTOA）病情程度的關(guān)系

3 討論

PTOA 好發(fā)于年輕人群，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量，且由于年輕人不適合行關(guān)節(jié)融合或置換術(shù)，給家庭、社會帶來較大負(fù)擔(dān)，故加強對 PTOA 的研究意義重大。

3.1 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 鑒別診斷PTOA、RA 的價值

RA 是與 PTOA 相似的一種關(guān)節(jié)疾病，兩者臨床特征相似，鑒別診斷存在一定難度。MMP-1 是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，A2M主要由肝臟等產(chǎn)生，具有廣譜蛋白酶抑制作用。但目前關(guān)于 MMP-1、A2M 在 RA、PTOA 中表達(dá)水平比較的報道較少。本研究結(jié)果顯示，PTOA 病人軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 低于 RA 病人，可能與 RA 病人基質(zhì)金屬蛋白酶∕金屬蛋白酶組織抑制因子失衡嚴(yán)重有關(guān)。且 MMP-1 mRNA+A2M mRNA 鑒別 診 斷 PTOA、RA 的 AUC 為 0.909，大于單一的MMP-1 mRNA、A2M mRNA，靈敏度為 89.47%，特異度為 80.56%，呈現(xiàn)出較高價值，可為臨床鑒別診斷PTOA、RA 提供量化參考。

3.2 MMP-1 mRNA 在 PTOA 軟骨中表達(dá)及與病情的相關(guān)性

MMP-1 可降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維和明膠，改變細(xì)胞的微環(huán)境，破壞細(xì)胞外基質(zhì)，不利于損傷細(xì)胞的修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-1 mRNA 與 PTOA 病情程度、KSS、HSS 評分顯著相關(guān)，提示檢測 MMP-1 mRNA 表達(dá)可評估 PTOA 病人病情嚴(yán)重程度與關(guān)節(jié)功能。根據(jù) Xu 等研究，MMP-1基因多態(tài)性與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病密切相關(guān)。動物學(xué)研究表明，MMP-1 在 RA 大鼠模型中呈高表達(dá)，與病情的改善有關(guān)，支持本研究結(jié)論。PTOA 病人關(guān)節(jié)存在炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)白介素-1、腫瘤壞死因子-α 等炎性因子，并介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，對軟骨細(xì)胞保護(hù)作用減弱，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞受損、壞死，軟骨層變薄等退變現(xiàn)象，因此可引起疼痛、關(guān)節(jié)活動受限等癥狀體征，且 MMP-1 水平越高，基質(zhì)金屬蛋白酶∕金屬蛋白酶組織抑制因子失衡越明顯，軟骨破壞越嚴(yán)重，故病人病情越嚴(yán)重。表明抑制 MMP-1 表達(dá)可能有助于 PTOA 病人病情及關(guān)節(jié)功能的改善。

表3 MMP-1 mRNA、A2M mRNA對PTOA、RA鑒別診斷的 ROC分析結(jié)果

3.3 A2M mRNA 在 PTOA 軟骨中表達(dá)及與病情的相關(guān)性

A2M 是血漿中分子量最大的蛋白質(zhì)，能結(jié)合多種離子、分子、蛋白水解酶。本研究結(jié)果顯示，隨病情分級增加呈逐漸升高趨勢，A2M mRNA表達(dá)量呈下降趨勢，A2M mRNA 與 PTOA 病情程度、KSS、HSS 評分顯著相關(guān) ，提示檢測 A2M 可 評 估PTOA 病人病情與關(guān)節(jié)功能。Li 等報道顯示，早期補充 A2M 能通過抑制膠原蛋白Ⅱ誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型中的炎癥來減輕軟骨和骨骺損傷，從側(cè)面論證了本研究 A2M mRNA 表達(dá)量與 KSS、HSS 評分呈正相關(guān)的結(jié)論。Liu 等研究指出，下調(diào)軟骨細(xì)胞中miR-146b 的表達(dá)，可抑制白介素-1β 誘導(dǎo)的胱天蛋白酶活化和蛋白水解酶的表達(dá)，起到軟骨保護(hù)與抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展作用，采用螢光素酶報告基因測定證實，軟骨細(xì)胞中 A2M mRNA 是 miR-146b 的 靶 基因，提示調(diào)控 A2M mRNA 表達(dá)，可能為 PTOA 的保守治療提供一個潛在思路。分析其原因可能是，A2M能通過抑制 MMP-1 等基質(zhì)金屬蛋白酶，保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶∕金屬蛋白酶組織抑制因子動態(tài)平衡的恢復(fù)與軟骨細(xì)胞微環(huán)境的改善，防止軟骨細(xì)胞的破壞，故是 PTOA 病人病情的保護(hù)因素，與 KSS、HSS 評分呈正相關(guān)。本研究不足之處在于，納入病例數(shù)較少，可能會影響數(shù)據(jù)，且軟骨組織標(biāo)本的采集具有一定創(chuàng)傷 ，仍需后續(xù)的進(jìn)一步完善。

軟骨中 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 可診斷鑒別PTOA、RA，并與 PTOA 病人病情、關(guān)節(jié)功能顯著相關(guān) ，調(diào) 控 MMP-1 mRNA、A2M mRNA 表 達(dá) 可 能 為PTOA 的治療提供了一個潛在思路。