YAP 干擾腺病毒載體對(duì)宮頸癌增殖、遷移及侵襲的影響

王紅 ，王懇 ，焦慶昉 ，楊萬(wàn)全 ，張鎮(zhèn) ，李婕婷 ，吳扶生 ，王瑾

作者單位：1 四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610041；2 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院血液科，河南 洛陽(yáng) 471003

宮頸癌是婦科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)宮頸癌的新確診病例超過(guò) 52.98 萬(wàn)∕年，是婦女癌癥死亡的主要原因之一，其中大部分病人集中在發(fā)展中國(guó)家。目前手術(shù)、化療及放療是治療宮頸癌的主要手段，但大部分病人仍發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致大部分病人的生存率無(wú)明顯提高。Yes-associated protein（YAP）是 Hippo 信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄激活因子，YAP 蛋白參與了腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過(guò)程，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本團(tuán)隊(duì)于 2017年 7月至 2018年 10月利用腺病毒靶向 YAP 干擾載體（pAd-si-YAP），了解 YAP 蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞的惡性增殖及侵襲性的作用，為全方面了解宮頸癌的分子生物學(xué)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

pAd-si-YAP、重組空載體腺病毒（pAdmock）均由中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院構(gòu)建。人宮頸癌 CaSki 細(xì)胞株由中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八九醫(yī)院保存。DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó) HyClone 公司；Transwell 培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；鼠抗人 β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）及 YAP 抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司；RNase、碘化丙啶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）引物由TaKaRa 公司合成，測(cè)序也由該公司完成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞感染

配置好含 10% 胎牛血清、100 U∕mL 青霉素及 100 U∕mL 鏈霉素細(xì)胞培養(yǎng)液，將 CaSki 細(xì)胞置于 37 ℃、5% 二氧化碳細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將 CaSki 細(xì)胞接種于 6 孔板中，待密度約為 80% 時(shí)，取二孔細(xì)胞計(jì)數(shù)后 ，加入200感染復(fù)數(shù)（MOI）的重組腺病毒pAd-si-YAP 及無(wú)血清的 DMEM，感染 2 h 后，1 000 r∕min×5 min 離心后棄上清，加入含有血清的 DMEM完全培養(yǎng)液；取二孔細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入 200 MOI 的pAd-mock 及無(wú)血 清 的 DMEM，感染 2 h 后，1 000 r∕min×5 min 離心后棄上清，加入含有血清的 DMEM完全培養(yǎng)液。另取二孔細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）作為空白對(duì)照。由于腺病毒載體中含有編碼的綠色熒光蛋白（GFP）基因，因此可在熒光顯微鏡下觀察感染效率情況。待 CaSki 細(xì)胞感染 48 h 后，隨機(jī)選擇 6 個(gè)視野計(jì)數(shù)，在熒光顯微鏡下觀察病毒感染情況，計(jì)算綠色熒光細(xì)胞 占全部細(xì)胞的比例。

1.3 qPCR 檢測(cè) YAP mRNA 的表達(dá)

收集培養(yǎng)48 h的感染細(xì)胞及正常CaSki細(xì)胞，利用 Trizol 法提取CaSki 細(xì)胞的總 RNA，進(jìn)行 qPCR 并進(jìn)行定量。根據(jù)GeneBank 中YAP及 β-actin 設(shè)計(jì)引物并由 TaKaRa公司合成。YAP 正向引物 5’-CCG CAA CTG CAG ATG GAG AC-3’，反向引物 5’-CCA TCC CGG GAG AAG ACA CA-3’，β -actin 正向引物 5’-CCT CGT CCC CTA CAT CGT-3’，反向引物 5’-GAC GGT GTA GCC CCA CGA AA-3’。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃變性1 min，60 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，72 ℃ 50 s，33 個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸 10 min。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè) YAP 蛋白表達(dá)

CaSki 細(xì)胞感染重組腺病毒 Ad-si-YAP 及pAd-mock 48 h 后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品加樣 60 微克∕孔，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，然后加入一抗 4 ℃過(guò)夜，后 TBST 緩沖液洗膜3 次，每次洗膜 10 min 后，再與 HRP 標(biāo)記的二抗（1∶3 000 稀釋，即 3 mL 牛奶中加 1 μL 二抗），室溫下孵育 1 h。后再予 TBST 緩沖液洗滌 3 次后，應(yīng)用 ECL化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)目的蛋白表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT 法）檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

根據(jù)“1.2”方法制備 Ad-si-YAP及 pAd-mock 感染細(xì)胞，計(jì)數(shù)約 10 000 個(gè)細(xì)胞∕孔接種于 96 孔板，后放回細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于接種后 24、36、48、60 h 取出一塊 96 孔板，加入 20 μL 6 g∕L 的 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），后繼續(xù)孵育 4 h 后，棄上液，加入 150 μL 的二甲基亞砜（DMSO），震蕩約 15 min 后于酶標(biāo)儀 560 nm 處測(cè)吸光度。

1.6 流式細(xì)胞儀測(cè)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡

分別用Ad-si-YAP 及 pAd-mock 感染細(xì)胞 48 h 后，收集細(xì)胞，加入 70% 乙醇固定，后放入 4 ℃冰箱過(guò)夜，后用 PBS清洗，后加入核糖核酸酶 A（RNase A），在 37 ℃水浴30 min，后碘化丙啶（PI）避光染色 30 min，后應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期及凋亡。

1.7 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

CaSki 細(xì)胞以 3×10密度接種于 6 孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到 80%，用 10 μL 小槍頭行“一”字劃痕，后丟棄培養(yǎng)基，PBS輕輕清洗 3 次，后加入 5% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照，于此時(shí)記為 0 h，后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，后在同一觀察點(diǎn)觀察劃痕愈合情況，通過(guò)計(jì)算觀察點(diǎn)劃痕寬度平均值，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h 劃痕寬度―24 h 劃痕寬度）∕0 h 劃痕寬度×100%。

1.8 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

取 24 孔板并加入 600 μL 不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基，將 Transwell 小室及侵襲小室放入 24 孔板中，放入 37 ℃細(xì)胞孵箱中平衡備用。接種 CaSki 細(xì)胞于 6 孔板中，經(jīng)過(guò) 12 h 培養(yǎng)后，分別予 Ad-si-YAP 及 pAd-mock 感染細(xì)胞 12 h，對(duì)照組予PBS 處理，后用胰酶消化細(xì)胞呈懸液后，以每孔 5×10∕200 μL 接種予經(jīng)過(guò)平衡的處理的 Transwell 小室及侵襲小室，于 37 ℃細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后去除 Transwell 小室及侵襲小室中殘液，于冰甲醛中固定 15 min，后予 0.1% 的結(jié)晶紫染色液中染色 20 min，PBS 清洗后晾干，每孔隨機(jī)取 5 視野于 100 倍鏡下計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 pAd-si-YAP 及 pAd-mock 感染 CaSki 細(xì)胞

pAd-si-YAP 感染效率為（93.1±2.4）% ，pAd-mock 感染效率為（92.8±3.1）%，見(jiàn)圖1。

圖1 熒光顯微鏡下觀察宮頸癌CaSki細(xì)胞感染48 h后病毒感染情況（×10）：A為腺病毒靶向YAP干擾載體（pAd-si-YAP）感染CaSki細(xì)胞；B為重組空載體腺病毒（pAd-mock）感染CaSki細(xì)胞

2.2 qPCR 檢測(cè)YAP mRNA 的表達(dá)

Ad-si-YAP感染 CaSki 細(xì)胞的 YAP mRNA 表達(dá)明顯低于 pAdmock 感染的 CaSki 細(xì)胞及 PBS 處理的CaSki 細(xì)胞［（22.01±0.24）比（80.12±0.31）、（84.18±0.22），

P

＜0.05］，表明 Ad-si-YAP 可以抑制 YAP 基因轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) YAP 蛋白表達(dá)

Ad-si-YAP感染 CaSki 細(xì)胞的 YAP 蛋白表達(dá)低于 pAd-mock 感染 的 CaSki 細(xì)胞及PBS處理的 CaSki 細(xì)胞［（0.6±0.018）比（1.5±0.031）、（1.8±0.27），

P

＜0.05］，表明 Adsi-YAP 可以干擾 YAP 基因表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)宮頸癌 CaSki 細(xì)胞 YAP 蛋白表達(dá)

2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

24 h 后 pAd-mock感染的 CaSki 細(xì)胞及 PBS 處理的 CaSki 細(xì)胞增殖明顯快于 Ad-si-YAP 感染 CaSki 細(xì)胞（

P

＜0.05），而 pAdmock 感染的 CaSki 細(xì)胞相比 PBS 處理的 CaSki 細(xì)胞增殖趨勢(shì)大致相同（

P

＞0.05），說(shuō)明沉默 YAP 基因可以抑制 CaSki 細(xì)胞增殖。見(jiàn)表1。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡分析

本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默 YAP 后，CaSki 細(xì)胞周期停滯于 G0∕G1 期明顯增加（

P

＜0.05），同時(shí) CaSki 細(xì)胞增多（

P

＜0.01），而 pAd-mock 感染的 CaSki 細(xì)胞相比 PBS 處理的 CaSki 細(xì)胞周期分布及凋亡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見(jiàn)表2。

表1 MTT 法檢測(cè)宮頸癌 CaSki 細(xì)胞增殖活力（吸光度）結(jié)果∕

表2 流式細(xì)胞儀測(cè)檢測(cè) CaSki 細(xì)胞周期分布及凋亡結(jié)果∕（%，）

2.6 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

沉 默 YAP 后CaSki 細(xì)胞的劃痕愈合占比下降［（40.01±0.16）%比（81.02±0.22）%、（86.04±0.31）%，

P

＜0.05］，從而說(shuō)明YAP 可以促進(jìn)CaSki 細(xì)胞遷移。

2.7 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)

沉默 YAP 后 CaSki 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)下降［（120±4）個(gè) 比（640±3）個(gè) 、（680±4）個(gè)，

P

＜0.05］，而 pAd-mock 感染的 CaSki 細(xì)胞及 PBS處理的 CaSki 細(xì)胞 ，其侵襲力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（640±3）個(gè)比（680±4）個(gè)，

P

＞0.05］，說(shuō)明 YAP 可以提高 CaSki 細(xì)胞侵襲能力。

3 討論

宮頸癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，僅次于乳腺癌，占女性腫瘤第二位，嚴(yán)重威脅女性病人的生命，對(duì)社會(huì)及病人造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。大部分病人確診宮頸癌時(shí)，已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人預(yù)后很差。深入研究宮頸癌分子生物學(xué)特性，尋找更多潛在治療靶點(diǎn)，是擺在腫瘤科研人員面前的重要課題。YAP 基因位于染色體 11q22 區(qū)，被認(rèn)為是一種原癌基因，其編碼產(chǎn)生YAP 蛋白，作為一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，促進(jìn) Hippo 通路中的下游目的基因表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞凋亡，因此認(rèn)為 YAP 基因?yàn)樵┗?。如果YAP 異常活化，則 YAP 蛋白與轉(zhuǎn)錄 因 子 TEAD 相 結(jié)合促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并增強(qiáng)細(xì)胞增殖，可抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力。宮頸癌的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)為是多因素、多基因、多階段共同參與導(dǎo)致的結(jié)果，其中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展起著至關(guān)重要的作用?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)，Hippo-YAP 信號(hào)是眾多信號(hào)通路中，調(diào)節(jié)宮頸癌形成的一條重要傳導(dǎo)通路。YAP 是 Hippo 通路中的核心效應(yīng)因子，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等作用，而 Hippo-YAP 信號(hào)通路可調(diào)控機(jī)體器官的大小，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為，因而成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)。Liu 等采用免疫組織化學(xué)方法分析檢測(cè) 120例宮頸鱗狀細(xì)胞癌、42例宮頸腺癌、22例正常宮頸組織的 YAP 表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中的 YAP 表達(dá)進(jìn)行單獨(dú)分析，發(fā)現(xiàn)YAP 蛋白在腫瘤中表達(dá)水平明顯高于正常組織，而李娜等則證明 YAP 蛋白表達(dá)越高，宮頸癌的惡性侵襲性越強(qiáng)，同時(shí)病情進(jìn)展越快。

本團(tuán)隊(duì)在之前工作基礎(chǔ)上將 pAd-si-YAP 轉(zhuǎn)染CaSki 細(xì) 胞，發(fā)現(xiàn) Ad-si-YAP 可以抑制 CaSki 細(xì)胞的YAP 蛋白表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默 YAP 基因后 CaSki 細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生改變，S 期細(xì)胞比例減少，凋亡細(xì)胞增加，本團(tuán)隊(duì)擬下一步深入研究 YAP 蛋白與細(xì)胞周期蛋白之間的關(guān)系。腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制，涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及腫瘤微環(huán)境的相互作用，本研究發(fā)現(xiàn)沉默 YAP 基因后 CaSki 細(xì)胞的遷移能力及侵襲能力相對(duì)于對(duì)照組均有不同程度下降，本團(tuán)隊(duì)下一步將進(jìn)一步研究 Hippo-YAP 通路的具體作用機(jī)制及其如何與其他信號(hào)通路相互作用，為全方面了解宮頸癌的分子生物學(xué)機(jī)制提供依據(jù)，以期為宮頸癌綜合治療及 Hippo 信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)提供一個(gè)潛在靶點(diǎn)。