復(fù)方仙人掌軟膏的制備及總黃酮的含量測(cè)定

廖梅 ，陳小平 ，蒙其其

作者單位：1 嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031；2 廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州 514031

急性腮腺炎為常見的呼吸道傳染病，主要由腮腺病毒引起。該病的臨床表現(xiàn)以腮腺非化膿性炎癥和腮腺區(qū)腫痛為主，冬季和春季發(fā)病率較高，多發(fā)于兒童和青少年，臨床上多以對(duì)癥治療為主，兼顧抗病毒治療的方法進(jìn)行干預(yù)治療。復(fù)方仙人掌軟膏是我院的自制制劑，主要由仙人掌總黃酮 30份、青黛 6 份、冰片 1 份和軟膏基質(zhì)構(gòu)成，以三氯叔丁醇為防腐劑、月桂氮酮為促滲透劑、維生素 C 為抗氧化劑，用于急性腮腺炎的輔助治療，臨床療效較好。實(shí)踐證明仙人掌汁液外敷或與青黛、冰片合用治療腮腺炎療效顯著。仙人掌性味苦寒，具有清熱解毒，散瘀消腫，健胃止痛，鎮(zhèn)咳的功效，仙人掌總黃酮可以明顯抑制腫脹反應(yīng)及增加毛細(xì)血管通透性，可減輕局部炎癥反應(yīng)，其活性大小與總黃酮的劑量呈正相關(guān)，輔助治療流行性腮腺炎。青黛性味咸寒，具有清熱解毒、涼血消斑、瀉火定驚、抗炎 鎮(zhèn)痛等功效。青黛的抗炎鎮(zhèn)痛作用能夠有效緩解腮腺疼痛，其抗病毒作用則能有效對(duì)抗腮腺炎病毒。冰片具有通諸竅 ，散郁火，消腫止痛的功效，能夠有效減輕腮腺炎所致的腫脹及疼痛。為了提高病人用藥的依從性，保證制劑的工藝和質(zhì)量穩(wěn)定，確保臨床用藥安全，本實(shí)驗(yàn)于 2019年 6―12月優(yōu)化復(fù)方仙人掌軟膏的制備工藝并測(cè)定其總黃酮含量，初步評(píng)價(jià)該軟膏劑質(zhì)量，為該劑型的后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MS103DU 電子分析天平（梅特勒-托利多）；KDC-140HR 型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳公司）；Zetasizer Nano ZS90 粒度及電位測(cè)定儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；UV-1800 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（金壇市新航儀器廠）。

1.2 材料

化妝品級(jí)液體石蠟（批號(hào) P823840）、醫(yī)用級(jí)白凡士林（批號(hào) V820408）、藥用級(jí)水溶性月桂氮酮（批號(hào) A800359）、藥用級(jí)甘油（批號(hào) G810575）、藥用級(jí)十二烷基硫酸鈉（批號(hào) S817788）、藥用級(jí)三乙醇胺（批號(hào) T819271）、藥用級(jí)維生素 C（批號(hào)A800295）、藥用級(jí)硬脂酸（批號(hào) S817777）、藥用級(jí)單硬脂酸甘油酯（批號(hào) S818124）、藥用級(jí)三氯叔丁醇（批號(hào) T832418）和藥用級(jí) AB-8 大孔吸附樹脂（批號(hào)A875381）均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；蘆?。ㄅ?hào) B20771，純度≥98%）購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。食用仙人掌干品（批號(hào) 201910501）購(gòu)自安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院張正偉副主任中藥師鑒定為 米邦塔仙人掌

Opuntia Milpa

Alta，青黛（批號(hào)1001818）和冰片（批號(hào) 1001903）由廣東恒祥藥業(yè)股份有限公司提供，經(jīng)鑒定符合中國(guó)藥典 2015年版相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 仙人掌總黃酮的提取及純化

取仙人掌粗粉5.0 kg，加入 10 倍量 70% 乙醇浸泡 30 min，回流提取2 h，過濾，濾渣重復(fù)提取 1 次，過濾，合并 2 次提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮至密度為 1.02～1.03 g∕mL（按總生藥量計(jì)為 0.5 g∕mL），備用。取 AB-8 大孔吸附樹脂裝柱（5 cm×50 cm），預(yù)處理后，將上述提取液以1 BV∕h 進(jìn)行上柱、吸附，用 1% 三氯化鐵乙醇溶液檢測(cè)流出液，待反應(yīng)呈陽(yáng)性停止上樣。依次用 5 倍柱體積的水、30% 乙醇、70% 乙醇以 1 BV∕h 進(jìn)行洗脫，收集 70% 乙醇洗脫液，經(jīng)適當(dāng)減壓濃縮后冷凍干燥，得到棕色粉末 105 g，即為仙人掌總黃酮，備用。

2.2 軟膏基質(zhì)的制備

按基質(zhì)處方量分別稱取油相、水相于燒杯中，在水浴鍋中加熱至 75 ℃，攪拌均勻；控制水相溫度高于油相溫度 2～3 ℃，維持油相溫度在 75 ℃下將水相緩慢加入到油相中，攪拌均勻，置磁力攪拌器中攪拌 5 min 至冷凝。

2.3 處方評(píng)價(jià)方法

2.3.1 外觀評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)采用多人評(píng)分取平均值的形式對(duì)軟膏的色澤均勻度、質(zhì)地細(xì)膩度、涂抹分散性、清洗容易度進(jìn)行評(píng)分，各占 10 分，總分 40分。評(píng)分細(xì)則：8～10 分表示色澤均勻，細(xì)膩無顆粒感，易涂抹和清洗；5～7 分表示均勻度一般，有稍微顆粒感，較難涂抹和清洗；4 分以下表示不均勻，存在明顯色塊，粗糙有顆粒感，難以涂抹清洗。

2.3.2 離心穩(wěn)定性試驗(yàn) 取基質(zhì) 3 g 置于 10 mL 離心管中，2 500 r∕min 離心 30 min 后取出，涂抹于載玻片上 ，觀察其有無油水分層 、破乳及變粗等現(xiàn)象。10 分以下為出現(xiàn)變粗、破乳、油水分層等顯著異?，F(xiàn)象；10 分以上無顯著異?，F(xiàn)象，總分 20 分。

2.3.3 耐寒耐熱試驗(yàn) 取基質(zhì) 3 g 裝入密閉的塑料盒中，分別置于-18 ℃冰箱中靜置 24 h 和 55 ℃烘箱中恒溫 6 h，取出觀察樣品是否出現(xiàn)變粗、破乳以及油水分層等現(xiàn)象。10 分以下為出現(xiàn)變粗、破乳、油水分層等顯著異常現(xiàn)象；10 分以上無顯著異?，F(xiàn)象，總分為耐寒試驗(yàn)與耐熱試驗(yàn)各 20 分。

2.4 基質(zhì)配比篩選

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，參考其他中藥軟膏劑基質(zhì)中油相、水相和乳化劑的用量，暫擬定 6種不同的基質(zhì)處方（見表1），制備軟膏基質(zhì)，以“2.3”項(xiàng)下內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果顯示處方 5 評(píng)分最高，因此，選定處方 5 作為待考察基質(zhì)處方。然后對(duì)基質(zhì)成型性影響較大的硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三乙醇胺和十二烷基硫酸鈉用量進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察。固定基質(zhì)中其他成分的用量不變，改變 1 種成分的用量，并按“2.2”項(xiàng)下方法制備軟膏基質(zhì)。以“2.3”項(xiàng)下內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選每個(gè)因素的最佳用量范圍。單因素結(jié)果顯示當(dāng)硬脂酸用量為 1.0 g、3.0 g、5.0 g，單硬脂酸甘油酯用量為 1 g、1.5 g、2.0 g，三乙醇胺用量為 0.12 g、0.14 g、0.16 g，十二烷基硫酸鈉用量為 0.10 g、0.12 g、0.14 g 時(shí)，均能形成表面光滑、均勻細(xì)膩、涂布性能好、易于清洗且穩(wěn)定性較好的軟膏基質(zhì)，符合軟膏劑基本質(zhì)量要求。

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取硬脂酸（A）、單硬脂酸甘油酯（B）、三乙醇胺（C）和十二烷基硫酸鈉（D）的用量為考查要素，按 L（3）因素水平表（見表2），進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以“2.3”項(xiàng)下內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算并比較綜合評(píng)分，篩選軟膏最優(yōu)處方組成及用量，結(jié)果見表3，4。從表4中直觀分析的

R

值可得，A、B、C、D 四個(gè)因素對(duì)軟膏成型的影響大小為 A ＞ D ＞ C ＞ B，最佳基質(zhì)處方用量為 ABCD。表5 方差分析結(jié)果顯示，A、B、C 和 D因素即硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三乙醇胺和十二烷基硫酸鈉的用量對(duì)軟膏成型性的綜合評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。因此，綜合分析確定軟膏的最優(yōu)處方組成為 ABCD。即硬脂酸用量為 1 g、單硬脂酸甘油酯用量為 1 g，三乙醇胺用量為 0.16 g、十二烷基硫酸鈉用量為 0.14 g。

表1 復(fù)方仙人掌軟膏制備基質(zhì)處方篩選結(jié)果∕g

表2 復(fù)方仙人掌軟膏制備正交實(shí)驗(yàn)因素水平表∕g

表3 復(fù)方仙人掌軟膏制備 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 復(fù)方仙人掌軟膏制備直觀分析結(jié)果

表5 復(fù)方仙人掌軟膏制備方差分析結(jié)果

2.6 乳化溫度和時(shí)間的確定

報(bào)道顯示軟膏劑的乳化溫度一般為70～95 ℃，乳化時(shí)間一般為 5～10 min。按照最佳基質(zhì)處方用量制備軟膏基質(zhì)，考察不同乳化溫度和時(shí)間對(duì)軟膏基質(zhì)成型性的影響，以“2.3”項(xiàng)內(nèi)容為評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)合粒徑大小和分散性系數(shù)（PDI 值）綜合分析。結(jié)果顯示乳化溫度為 75 ℃和 85 ℃時(shí)制得的軟膏外觀均勻細(xì)膩、易涂抹、易清洗；乳化溫度為 90 ℃時(shí)軟膏較難清洗和涂抹，膚感較差；乳化溫度為 75 ℃、乳化時(shí)間為 5 min 時(shí)制備的軟膏粒徑和 PDI 值較小，細(xì)膩松軟，有光澤，外觀良好。因此，選擇乳化溫度 75 ℃，乳化時(shí)間 5 min。

2.7 復(fù)方仙人掌軟膏的制備

分別稱取硬脂酸 1.0 g、單硬脂酸甘油酯 1.0 g、液體石蠟 3.0 g、白凡士林1.5 g 于燒杯中，作為油相；另稱取甘油 3.0 g、十二烷基硫酸鈉 0.14 g、三乙醇胺 0.16 g、三氯叔丁醇 0.15 g、月桂氮酮 0.15 g、純化水 19.85 g，作為水相。精密稱取 1.5 g 仙人掌總黃酮加入到水相中，0.3 g 青黛研磨成極細(xì)粉后加入到油相中。將水相與油相分別在 75 ℃下攪拌至混勻，維持油相溫度在 75 ℃，將水相緩緩加入到油相中，待基質(zhì)冷至 40 ℃時(shí)加入用0.5 mL 無水乙醇溶解的冰片 0.05 g 和維生素 C 細(xì)粉0.05 g，邊加邊攪拌，置磁力攪拌器中繼續(xù)攪拌至冷凝，即得淺灰色軟膏。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及初步質(zhì)量評(píng)價(jià)

采用最佳處方配比，放大 10 倍量，按“2.7”項(xiàng)下方法分別制備復(fù)方仙人掌軟膏，共制備 3 批，按“2.3”項(xiàng)下的評(píng)價(jià)方法對(duì)軟膏色澤均勻度、質(zhì)地細(xì)膩度、涂抹分散性、清洗容易度和穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果見表6，三批驗(yàn)證試驗(yàn)所制備的軟膏細(xì)膩均勻，無粗糙感，膏體松軟，稠厚適中，有光澤，易涂展，質(zhì)量穩(wěn)定。

稱取 1 g 軟膏于燒杯中，蒸餾水稀釋 400 倍，混勻呈淺灰色液體，粒徑測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示軟膏劑平均粒徑為 633.5 nm，PDI 為 0.531，表明該軟膏的平均粒徑較小、分布均勻，符合軟膏劑粒徑要求。

2.9 復(fù)方仙人掌軟膏總黃酮的含量測(cè)定

2.9.1 總黃酮測(cè)定方法 參照文獻(xiàn)［19］，取一定體積的樣品溶液置于 25 mL 容量瓶中，加 70% 乙醇至6 mL，加 5% 亞硝酸鈉溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加 10% 硝酸鋁溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加 4% 氫氧化鈉溶液 10 mL，加 70% 乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以不加仙人掌總黃酮的空白制劑按上述操作得到空白溶液，在 510 nm 處測(cè)定溶液吸光度。

2.9.2 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品 25 mg 精密稱定，置 25 mL 容量瓶中，加 70% 乙醇適量，超聲30 min 使其完全溶解，放冷至室溫，70% 乙醇定容至刻度，即得 1 g∕L 的對(duì)照品溶液。

2.9.3 供試品溶液的制備 精密稱取復(fù)方仙人掌軟膏 5.0 g，加入 70% 乙醇 80 mL，水浴回流 1 h，微孔濾膜過濾至 100 mL 量瓶中，加 70% 乙醇稀釋至刻度，作為供試品溶液，精密量取該供試品溶液 1 mL置于 25 mL 容量瓶中按“2.9.1”項(xiàng)下步驟測(cè)定分析。

2.9.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液 0 mL，0.25 mL，0.5 mL，1 mL，1.5 mL，2 mL，2.5 mL 分別置于 25 mL 容量瓶中，按“2.9.1”方法進(jìn)行測(cè)定。以第一瓶溶液作為空白對(duì)照調(diào)零，以蘆丁濃度

C

為橫坐標(biāo)，吸光度

A

為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

A

=11.546

C

+0.009 6，

R

2=0.999 5。結(jié)果表明蘆丁在 0.01～0.10 g∕L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表6 復(fù)方仙人掌軟膏制備驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9.5 精密度試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液 1 mL 置于 25 mL 容量瓶中，連續(xù)測(cè)定 6 次吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值。結(jié)果顯示其 RSD 為 0.45%，結(jié)果表明該方法儀器精密度符合分析要求。

2.9.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次（1901）軟膏樣品 6份，按照“2.9.3”項(xiàng)下同法操作，測(cè)定各樣品的吸光度，計(jì)算其總黃酮含量。結(jié)果顯示其計(jì)算值的 RSD值為 2.05%（

n

=6），說明該方法重復(fù)性良好。2.9.7 回收率實(shí)驗(yàn) 稱取已知含量的軟膏 2.5 g，平行稱定 6 份，加入對(duì)照品適量，按照“2.9.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算其加樣回收率。結(jié)果顯示，總黃酮的平均加樣回收率為93.60%，RSD 值 為2.40%（

n

=6），表明該方法準(zhǔn)確可行。見表7。

表7 復(fù)方仙人掌軟膏總黃酮的含量測(cè)定回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9.8 含量測(cè)定 分別稱取各批次樣品 5.0 g，按照“2.9.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，平行制備 3 份，依法測(cè)定并計(jì)算其含量。3 批樣品的總黃酮量含量分別為（32.62±0.15）、（33.19±0.23）、（31.46±0.09）mg∕g，平均含量為（32.42±0.77）mg∕g，其 RSD 值 為 2.39%，結(jié)果表明該方法制備的軟膏質(zhì)量穩(wěn)定。見表8。

表8 復(fù)方仙人掌軟膏總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

軟膏劑具有涂展性和黏附性良好、安全、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)皮給藥相對(duì)較為安全，病人的用藥依從性較高，不良反應(yīng)發(fā)生少，在治療流行性腮腺炎時(shí)，能夠持續(xù)對(duì)腮腺部位產(chǎn)生長(zhǎng)效作用。在 O∕W 型乳膏劑基質(zhì)中，多選擇十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、聚山梨酯 80 作為乳化劑。本實(shí)驗(yàn)從 6 種較為常用的軟膏基質(zhì)處方篩選出十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺合用作為乳化劑。在考察乳化溫度和乳化時(shí)間發(fā)現(xiàn)，乳化溫度為 90℃時(shí)，乳化時(shí)間為 5 min、10 min、20 min 時(shí)制備的軟膏難以清洗和涂抹，黏稠度大。推測(cè)原因?yàn)樵诖帕嚢杵鞯淖饔孟?，隨著溫度和時(shí)間的增加，基質(zhì)中的水份逐漸減少，乳化程度逐漸增大所致。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)法確定最佳基質(zhì)處方，同時(shí)考察乳化溫度和時(shí)間對(duì)基質(zhì)成型性的影響，對(duì)復(fù)方仙人掌軟膏進(jìn)行制備工藝優(yōu)化，最終得到淺灰色軟膏。質(zhì)量評(píng)價(jià)研究表明該法制備的軟膏細(xì)膩均勻、質(zhì)量穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)確定了復(fù)方仙人掌軟膏的制備工藝并初步評(píng)價(jià)該軟膏劑質(zhì)量，進(jìn)一步擴(kuò)大和開發(fā)了仙人掌的藥用價(jià)值，為該制劑的后續(xù)開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。