組織蛋白酶 L 對糖尿病大鼠腎臟炎癥及氧化應激指標的影響

邱敏，陳波

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院腎病科，云南 昆明 650000

全球糖尿病患病人數(shù)在不斷上升。糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥，也是導致糖尿病病人致殘和死亡的重要原因。炎癥反應和氧化應激在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用。因此，尋找抑制炎癥反應和氧化應激的有效調(diào)控靶點對糖尿病腎病的防治具有十分重要的科學意義。

組織蛋白酶 L（Cathepsin L，Cat L）具有木瓜蛋白酶家族的氨基酸序列，以酶原的形式貯存于溶酶體中，是一種有效的內(nèi)肽酶，與溶酶體蛋白的降解有關。該酶參與多種生物學和疾病發(fā)生發(fā)展過程，包括骨骼更新，肌肉變性，動脈硬化和癌癥轉移。Cat L 的表達異常與多種腎臟疾病的觸發(fā)有關，如膜性腎小球腎炎，微小變化疾病，局灶性節(jié)段性腎小球硬化和糖尿病腎病。有研究表明脂多糖或嘌呤霉素氨基核苷誘導足細胞 Cat L 高表達與蛋白尿的形成有關。相較于野生型小鼠，Cat L 基因敲除的小鼠未出現(xiàn)蛋白尿。最近有研究報道 Cat L 與炎癥反應和氧化應激的觸發(fā)有關。本研究于 2018年 6月至 2019年 5月擬通過觀察 Cat L 對糖尿病大鼠腎臟炎癥和氧化應激指標的影響，探討 Cat L 在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只健康雄性SPF級別 Sprague-Dawley（SD）大鼠（體質(zhì)量范圍為 240～270 g）購買自上海斯萊克實驗動物科技服務部。采用隨機數(shù)字表法分為對照組和糖尿病組，分別為 10 只和 20 只。擬糖尿病模型建立成功后，從糖尿病組取 10 只大鼠每天腹腔注射 10 mg∕kg Cat L 抑制劑 Z-FY-CHO，作為抑制劑組。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素（STZ）購買自美國 Sigma 公司；CatL抑制劑（Z-FY-CHO）購自美國的Santa Cruza 公司；檸檬酸和檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司；Cat L 活性檢測試劑盒購自上海銘博生物科技有限公司；丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）和谷胱甘肽試劑盒均購買自南京建成生物工程研究所；白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白細胞介素-1（IL-1）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購買自上海廣銳生物科技有限公司；DEPC 水購自碧云天生物科技有限公司；Trizol 裂解液購自美國 Invitrogen 公司 ；RNA 逆轉錄試劑盒及 SYBR? Green-ERTM SuperMix 購自大連寶生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；全自動生化分析儀購買自美國的 Beckman Coulter 公司；微量核酸蛋白測定儀購自美國的 Thermo Scientific 公司 ；StepOne Plus熒光定量PCR儀購自德國的Applied Biosystems 公司。

1.3 Ⅰ型糖尿病模型的建立

在模型建立前，先尾靜脈采血測定大鼠的血糖值。將 STZ 溶于 0.1 mol∕L的檸檬酸緩沖液中，以 65 mg∕kg 劑量腹腔注射到大鼠體內(nèi)，3 d 后檢測血糖濃度。血糖值≥16.7 mmol∕L表明糖尿病模型建立成功。實驗期間對照組與糖尿病組分別取 5 只大鼠每兩周測定血糖與體質(zhì)量。

1.4 血、尿標本的收集

建模后4周、8周 ，使用代謝籠收集三組大鼠 24 h 尿并記錄尿量，以 4 ℃、1 500 r∕min 離心 5 min 純化尿液后置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)的尿蛋白測定實驗。下腔靜脈采血后以 4 ℃、3 000

g

離心 10 min 取血清，全自動血液生化分析儀檢測血尿素氮和血肌酐。

1.5 實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測各組大鼠腎臟組織中 Cat L mRNA 水平

4周、8周時三組各處死 5 只大鼠并取腎臟組織，加 1 mL Trizol研磨裂解，提出總 RNA，75% 乙醇 DEPC 水溶液充分洗滌 ，待液體揮干 ，根據(jù)RNA沉淀量加入適量的DEPC 水溶解。微量核酸蛋白測定儀測量 RNA 的核酸濃度和純度，計算 RNA 的加樣體積。按照逆轉錄試劑盒的說明書，去除樣品中的基因組 DNA，再將RNA 反轉錄為模板互補 DNA（cDNA）。Cat L 引物序列為 ：正向 5’-TCTGTTGCTATGGACGCAAG-3’，反向 5’-CCGGTCTTTGGCTATTTTGA-3’。然后根據(jù)試劑盒說明書，確定擴增體系、進行擴增反應。

1.6 Cat L 活性檢測

根據(jù)試劑盒說明書，用比色法測定 Cat L 活性。

1.7 腎臟組織中的丙二醛、SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽含量測定

稱取適量的大鼠腎臟組織，于冰水浴下研磨制備腎組織勻漿，低溫離心后留取上清。按照試劑盒說明書測定丙二醛、SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平。

1.8 ELISA 檢測腎臟組織中的 IL-1、IL-6 和 TNF-α水平

將抗原稀釋后加到各孔中，37 ℃條件下孵育4 h 后棄去；用 5% 小牛血清于 37 ℃下孵育 40 min，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗；接著加入待測樣品，37 ℃孵育 30～45 min，PBS 洗滌；然后加酶標抗體，37 ℃孵育 40 min，PBS 洗滌；再加入底物液，37 ℃避光孵育 5 min；加終止液顯色，測定 IL-1、IL-6 和 TNFα 水平。

2 結果

2.1 糖尿病大鼠的血糖和體質(zhì)量情況

STZ 注射后，每兩周測定大鼠血糖 和體質(zhì)量。與對照組相比，糖尿病大鼠血糖持續(xù)增高，體質(zhì)量逐漸減輕（

P

＜0.05），見表1，證明糖尿病模型建立成功。

2.2 糖尿病大鼠腎臟組織中 Cat L 表達和活性增加

建模后 4周、8周對照組與糖尿病組各收集并檢測 5 只大鼠腎臟組織，與對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠腎臟組織中 Cat L 的 mRNA 表達和活性顯著增高（

P

＜0.05），見表2。

2.3 Cat L 拮抗劑減輕了糖尿病大鼠的腎功能損傷

相比于正常對照組，糖尿病大鼠尿量、尿蛋白和血尿素氮水平在第4周顯著增高（

P

＜0.05），Cat L拮抗劑處理抑制了糖尿病引起的尿量增加。而在第8周，糖尿病大鼠尿量、尿蛋白和血尿素氮、血肌酐水平均高于對照組大鼠（

P

＜0.05），Cat L 拮抗劑處理抑制了這一改變（

P

＜0.05）。見表3。

表1 每兩周測定兩組大鼠血糖和體質(zhì)量比較∕

表2 兩組大鼠 4周、8周腎臟組織中組織蛋白酶 L（Cat L）mRNA 表達和活性比較∕

2.4 抑制 Cat L 對糖尿病大鼠腎組織中炎性因子水平的影響

糖尿病模型建立后 4周，與正常對照大鼠相比，糖尿病組大鼠腎組織中炎性因子 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平升高（

P

＜0.05），Cat L 拮抗劑抑制了糖尿病引起的 TNF-α 和 IL-1 增加（

P

＜0.05）。在第8周，糖尿病腎組織中 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平高于對照組（

P

＜0.05），且 Cat L 拮抗劑抑制了糖尿病引起的 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平升高（

P

＜0.05）。見表4。

2.5 抑制 Cat L 對糖尿病大鼠腎組織氧化應激指標的影響

STZ 注射后 4周，相比與對照組，糖尿病組大鼠腎組織中丙二醛水平增高，SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平降低（

P

＜0.05）；Cat L 拮抗劑處理組大鼠腎組織中 SOD、GSH-Px 水平較糖尿病組升高（

P

＜0.05）。在第8周，糖尿病組丙二醛水平增高，SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平降低（

P

＜0.05），而 Cat L 拮抗劑處理抑制了這些改變（

P

＜0.05）。見表5。

3 討論

糖尿病腎病是導致終末腎衰竭的重要原因。而高糖介導的氧化應激和炎癥反應在糖尿病腎病發(fā)展過程中起到關鍵作用。Cat L 是一種重要的溶酶體半胱氨酸蛋白酶，很多研究報道 Cat L 與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。本研究使用 Cat L 拮抗劑以明確 Cat L 對糖尿病大鼠腎臟炎癥反應和氧化應激的影響。

表3 三組大鼠 4周、8周尿量、尿蛋白和血尿素氮、血肌酐水平比較

表4 三組大鼠 4周、8周腎組織中炎性因子 IL-1、IL-6 和 TNF-α 水平比較∕（ng∕L

表5 三組大鼠 4周、8周腎組織丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）和谷胱甘肽含量的比較

實驗期間每兩周測定 1 次大鼠血糖和體質(zhì)量，我們發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的血糖顯著高于對照組、體質(zhì)量明顯低于對照組，證明糖尿病模型制備成功。然后，我們檢測了正常大鼠和糖尿病大鼠腎臟組織中的 Cat L 表達和活性，發(fā)現(xiàn)高糖可導致 Cat L mRNA高表達且活性增加，提示 Cat L 與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展可能存在某種關聯(lián)。

糖尿病可使腎小球濾過功能障礙，導致尿量和尿蛋白含量增加。此外，血尿素氮和血肌酐也可反映腎臟功能。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，伴隨著腎臟組織 Cat L 高表達，糖尿病大鼠尿量、尿蛋白含量和血尿素氮、血肌酐水平均升高，而 Cat L 抑制了這一現(xiàn)象，表明 Cat L 介導了糖尿病腎功能損傷的發(fā)生。

高血糖可觸發(fā)機體的炎癥反應和氧化應激，導致細胞死亡。有效抑制糖尿病病人的炎癥和氧化應激反應可減輕高糖引起的組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎組織中炎性因子 IL-1、IL-6 和 TNF-α水平增高，而 Cat L 阻斷劑抑制了高糖引起的腎臟炎性因子水平增高，提示 Cat L 可促進糖尿病腎臟炎癥反應的發(fā)生。SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽是體內(nèi)重要的抗氧化劑，參與氧自由基的清除。自由基可攻擊生物膜，使膜脂質(zhì)過氧化導致丙二醛水平升高。我們的結果表明拮抗 Cat L 抑制了糖尿病引起的腎組織 SOD、GSH-Px 和谷胱甘肽水平降低和丙二醛水平升高，表明 Cat L 可介導糖尿病腎臟氧化應激的發(fā)生。

綜上所述，Cat L 可促進糖尿病大鼠腎臟炎癥反應和氧化應激的發(fā)生，進而引起腎功能損傷。我們的研究為糖尿病腎病的防治提供了新的參考數(shù)據(jù)。但 Cat L 介導炎癥反應和氧化應激的機制還需進一步深入探索。