人參皂苷 Rg5 通過抑制蛋白激酶 B 信號通路調(diào)控肝癌 HepG2細胞生物學(xué)行為

郭慧，劉鵬飛

作者單位：湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 株洲 412000

肝癌是腫瘤相關(guān)性死亡的重要原因之一，我國是肝癌的高發(fā)區(qū)，每年有 11～13 萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡的 50% 以上；目前以手術(shù)切除為主的綜合治療是肝癌的主要治療手段，但其治療效果并不理想。人參皂苷是中藥材人參的主要活性成分之一，具有提高免疫、抗病毒、抗炎和抗腫瘤等廣泛的藥理作用；人參皂 苷 Rg5 是稀有人參 皂苷之一，可 通過影響腫瘤細胞增殖和凋 亡等抑制宮頸癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤細胞的生長，但其對肝癌細胞生長的影響并不清楚。因此，本研究通過常規(guī)生物學(xué)手段觀察人參皂苷 Rg5 對肝癌 HepG2細胞增殖、侵襲、遷移、周期和凋亡的影響，并探討其可能的分子機制，以揭示其對肝癌細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人參皂苷 Rg5（純度 98%）購于維克奇生物科技公司，洛斯維公園紀念所 1640 培養(yǎng)基（RPMI1640）、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗和胰蛋白酶購于美國 Gibco 公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）試劑和二甲基亞砜購于美國 Sigma 公司，RIPA 細胞裂解液購于上海碧云天公司，兔抗蛋白激酶 B（AKT）、磷酸化蛋白激酶 B（p-AKT）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP-9）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體購于美國 CST 公司，鼠抗細胞周期蛋白 D1（cyclin D1）單克隆抗體購于美國 Santa Cruz 公司，辣根過氧化酶標記的羊抗兔或鼠 IgG 抗體購于北京中杉金橋生物公司，細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、Braford 蛋白含量檢測試劑盒和電化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測試劑盒均購于南京凱基生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

將來自中科院上海細胞庫的肝癌HepG2 細胞解凍復(fù)蘇后，接種于含 100 U∕mL 青霉素鏈霉素雙抗和10% 胎牛血清的RPMI1640 培 養(yǎng) 基中，并在溫度為 37 ℃、濕度飽和、體積分數(shù)為 5% 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。每 2 天更換一次細胞液，定期觀察。待細胞鋪滿瓶底 85% 時，加入0.25% 胰蛋白酶消化，并按照 1∶3 比例傳代。實驗所用細胞為生長狀況良好的第3代對數(shù)生長期細胞。

1.3 細胞增殖實驗

將對數(shù)生長期的 HepG2 細胞以每孔 2×10個細胞種植于 96 孔細胞板上，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜。以 RPMI1640 培養(yǎng)基將人參皂苷 Rg5 的濃度調(diào)整為 10、20、40、80 和 160 μmol∕L。次日，棄細胞培養(yǎng)液后，加入終濃度為 10、20、40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5，并以不含人參皂苷 Rg5 的細胞作為對照（0 μmol∕L）組，另設(shè)置不含細胞的培養(yǎng)液作為空白對照組，每組設(shè)置 3 個復(fù)孔。分別在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24、48 和 72 h 后，每孔加入 20 μL 濃度為 5 mg∕mL 的 MTT 溶液，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4 h 后，加入 100 μL 二甲基亞砜震蕩反應(yīng)至 MTT 結(jié)晶完全溶解。采用酶標儀檢測各處理組細胞的吸光度（OD）值，并以（藥物組 OD-空白組 OD）∕（對照組 OD-空白組 OD）×100% 的值表示各組細胞的存活率。實驗重復(fù) 3 次。

1.4 細胞侵襲和遷移實驗

將對數(shù)生長期 的HepG2 細胞以每孔 100 μL（濃度 10個∕毫升）接種于24 孔細胞板上，于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜后，加入終濃度為 0、40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5，每組設(shè)置 3 個重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，胰蛋白酶消化收集各組細胞，并制成濃度為 10個∕毫升細胞懸液。 侵襲實驗：首先 ，以 50 μL Matrigel 溶液包被Transwell 小室的聚碳酸酯微孔膜，并在室溫下充分融合凝固（遷移實驗中無需該步驟）。在小室下層加入 600 μL 含血清培養(yǎng)基，上層中加入制備的細胞懸液 100 μL。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 后，取出小室。拭去上層內(nèi)殘留的細胞，分別以甲醛固定、結(jié)晶紫染色 15 min。洗去染色液后，自然晾干，在倒置顯微鏡下隨機選取 3 個視野統(tǒng)計穿過濾膜的細胞數(shù)（即侵襲細胞數(shù)）。遷移實驗：除了不需對 Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜進行包被外，其余步驟與侵襲實驗的步驟相同。實驗重復(fù) 3 次。

1.5 細胞周期和凋亡實驗

將對數(shù)生長期 的HepG2 細胞以每孔 2×10個細胞接種至 6 孔細胞板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。加入終濃度為 0、40、80和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5，每組設(shè)置 3 個復(fù)孔，培養(yǎng)箱內(nèi)處理 48 h 后，以胰蛋白酶消化收集各處理組細胞，并將其分為兩份，一份用以細胞周期檢測，一份用以細胞凋亡檢測。具體操作步驟參照細胞周期檢測試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒說明書。實驗重復(fù) 3 次。

1.6 AKT 信號通路相關(guān)蛋白表達實驗

將對數(shù)生長期的 HepG2 細胞以每孔 2×10個細胞接種至 6 孔細胞板上，孵育過夜后，加入終濃度為 0、40、80 和160 mol∕L 人參皂苷 Rg5，每孔設(shè)置 3 次復(fù)孔。孵育48 h 后，胰蛋白酶消化收集各組細胞，磷酸緩沖液洗滌細胞后，1 200 r∕min 低溫離心 5 min，棄上清，加入RIPA 細胞裂解液冰上裂解提取總蛋白，并以 Braford法檢測總蛋白的濃度。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液，混勻后，置于沸水浴中變性 5 min。在 SDSPAGE 凝膠孔中，加入各處理組蛋白樣品，40 mA 恒流電泳 2 h。以濕轉(zhuǎn)法將蛋白樣品轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上后，浸泡于含 5% 脫脂奶粉的封閉液中封閉 1 h。以一抗工作液（AKT 1∶1 000、p-AKT 1∶1 000、cyclin D1 1∶500、MMP-9 1∶800、Bcl-2 1∶1 000 和 GAPDH 1∶1 000）4 ℃孵育過夜后，置于二抗工作液（1∶2 000）中室溫孵育 1 h。 經(jīng) ECL 發(fā)光液顯影曝光后 ，以GAPDH 為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)分析各組細胞中目的蛋白的表達水平。實驗重復(fù) 3 次。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷 Rg5 對肝癌 HepG2 細 胞增殖的影響

在 24 h 作用時間下，40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5 的細胞存活率較對照（0 μmol∕L）組明顯降低（

P

＜0.05）；在 48 h 作用時間下，20、40、80 和 160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5 的細胞存活率均顯著低于對照（0 μmol∕L）組（

P

＜0.05）；而在 72 h 作用時間下，不同濃度的人參皂苷均可使 HepG2 細胞存活率低于 0 μmol∕L 組（

P

＜0.05）。計算得出，人參皂苷 Rg5 作用HepG2 細胞 24、48 和 72 h 后的半數(shù)抑制濃度（IC）值分別為 138.60、91.12 和 46.92 μmol∕L。故后續(xù)選用 40、80 和 160 μmol∕L 的人參皂苷 Rg5 進行實驗。見表1。

2.2 人參皂苷 Rg5 對肝癌 HepG2 細胞侵襲、遷移的影響

與對照（0 μmol∕L）組相 比 ，40、80 和 160 μmol∕L 處理組中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)均明顯降低（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 處理組顯著低于40 μmol∕L 處理組（

P

＜0.05）；但 160 μmol∕L 處理組與80 μmol∕L 處理組相比，侵襲和遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖1、表2。

表1 不同濃度人參皂苷 Rg5 處理后各組肝癌 HepG2 細胞的存活率∕（%，）

表2 各組肝癌 HepG2 細胞中侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)∕（個，）

2.3 人參皂苷 Rg5 對肝癌 HepG2 細胞周期的影響

人 參皂苷 Rg5 處 理后 HepG2 細胞在 G2∕M 期 的百分比與對照（0 μmol∕L）組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。與對照（0 μmol∕L）組相比，40、80 和160 μmol∕L 人參皂苷 Rg5 可使 HepG2 細胞在 G0∕G1期的百分比明顯升高（

P

＜0.05），而在 S 期的百分比明顯降低（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 人參皂苷Rg5 引起的細胞周期分布的變化明顯大于 40 μmol∕L（

P

＜0.05），但 80 μmol∕L 和 160 μmol∕L 處理組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表3。

表3 各組肝癌 HepG2 細胞的周期分布和凋亡率∕（%，）

2.4 人參皂苷 Rg5 對肝癌 HepG2 細胞凋亡的影響

與對照（0 μmol∕L）組相比，不同濃度的人參皂苷 Rg5 處理后 HepG2 細胞凋亡率均明顯升高（

P

＜0.05）；且 80 和 160 μmol∕L 處理組細胞凋亡率明顯高于 40 μmol∕L 處理組（

P

＜0.05）；但是，160 μmol∕L 處理組細胞凋亡率與 80 μmol∕L 處理組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖2、表3。

圖1 不同濃度人參皂苷Rg5對肝癌HepG2細胞侵襲、遷移的影響（結(jié)晶紫染色×400）：A為Transwell檢測侵襲實驗結(jié)果；B為Transwell檢測遷移實驗結(jié)果 圖2 流式細胞儀檢測不同濃度人參皂苷Rg5處理后各組肝癌HepG2細胞的凋亡情況

2.5 人參皂苷 Rg5 對肝癌細胞中 AKT、p-AKT、cy-

clin D1、MMP-9 和 Bcl-2 蛋白表達的影響

與對照（0 μmol∕L）組相比，人參皂苷 Rg5 處理后 HepG2 細胞中 AKT 蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），但 40、80 和 160 μmol∕L 處理組細胞中 p-AKT、cyclin D1、MMP-9 和 Bcl-2 的表達水平較對照（0 μmol∕L）組均明顯降低（

P

＜0.05），且高濃度 80 和 160 μmol∕L 的作用強度明顯大于低濃度 40 μmol∕L（

P

＜0.05）；而 160 μmol∕L 和 80 μmol∕L 的作用效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖3、表4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測不同濃度人參皂苷 Rg5 處理的肝癌 HepG2細胞 AKT 信號通路相關(guān)蛋白的表達

表4 各組肝癌 HepG2 細胞中 AKT 信號通路相關(guān)蛋白的表達情況

3 結(jié)論

人參是我國傳統(tǒng)的中藥材之一，含有豐富的皂苷類成分，其中人參皂苷 Rg3 已被作為腫瘤新生血管抑制劑批準上市，而人參皂苷 Rg5 在腫瘤中的研究還處在實驗階段。有學(xué)者在肺癌中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 具有一定的抗癌活性，可通過調(diào)控與凋亡相關(guān)的鈣調(diào)素樣蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、轉(zhuǎn)醛酶、膽綠素還原酶、醛脫氫酶、二氫蝶啶還原酶和活性反應(yīng) DNA 結(jié)合蛋白-43 的表達誘導(dǎo)癌細胞凋亡。Cui 等在視網(wǎng)膜母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 通過滅活 AKT 信號通路，抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并下調(diào) Bcl-2 的表達。有研究在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 可通過下調(diào)周期相關(guān)蛋白 cyclin D1、CyclinE2、周期素依賴性激酶 4（CDK4）和上調(diào)p21、p53 等的表達誘導(dǎo)細胞周期阻滯于 G0∕G1，抑制癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，李為等在胃癌中指出，人參皂苷 Rg5 可通過調(diào)控 miR-125b 表達抑制癌細胞侵襲和遷移。本研究以不同濃度的人參皂苷 Rg5 作用于肝癌 HepG2 細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 可呈時間-劑量依賴性抑制 HepG2細胞增殖；此外，還發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rg5 可誘導(dǎo) HepG2細胞周期阻滯于 G0∕G1 期，抑制 HepG2 細胞侵襲、遷移并促進細胞凋亡。該結(jié)果與人參皂苷 Rg5 在乳腺癌、胃癌中的抗腫瘤作用相吻合。這提示人參皂苷 Rg5 可通過抑制肝癌細胞增殖、侵襲、遷移和促進細胞凋亡發(fā)揮抗肝癌的作用。

磷脂酰肌醇-3-羥激酶（PI3K）∕AKT 信號通路是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，AKT 是 PI3K 下游的調(diào)節(jié)分子，活化的 AKT 以磷酸化形式存在，可通過影響下游轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 MMP-9、凋亡相關(guān)基因 Bcl-2、增殖相關(guān)基因 cyclin D1 等的表達，在調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡過程在發(fā)揮著重要作用，其過度活化與包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Liu 等和 Zhang 等分別在乳腺癌和食管癌中證實人參皂苷 Rg5 可通過抑制 AKT 信號通路的活化發(fā)揮抗腫瘤作用。為了進一步探討人參皂苷 Rg5 抗肝癌的分子機制，本研究采用蛋白質(zhì)印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg5 可使肝癌 HepG2 細胞中AKT 信號通路相關(guān)蛋白 p-AKT、cyclin D1、MMP-9 和Bcl-2 蛋白的表達水平明顯降低。這提示，人參皂苷Rg5 可能通過抑制 AKT 信號通路活化影響肝癌HepG2 細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡過程，進而發(fā)揮抗肝癌的作用。

綜上所述，人參皂苷 Rg5 可抑制肝癌 HepG2 細胞增殖、侵襲、遷移并誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡，其作用機制可能與抑制 AKT 信號通路的活化有關(guān)。該結(jié)果從細胞水平上闡述了人參皂苷 Rg5 對肝癌的作用，為人參皂苷 Rg5 在肝癌方面的深入研究奠定了基礎(chǔ)，也為肝癌的治療提供了新的線索。