Tortoside A對人宮頸癌SiHa細胞凋亡及細胞周期影響的初步研究

馬曉玲，劉雪松，柴麗華，陳剛，李寧，魏鴻雁

·論著·

Tortoside A對人宮頸癌SiHa細胞凋亡及細胞周期影響的初步研究

馬曉玲，劉雪松，柴麗華，陳剛，李寧，魏鴻雁

830002 烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所（馬曉玲、劉雪松、柴麗華、陳剛、魏鴻雁）；830046 烏魯木齊，新疆大學生命科學與技術學院（劉雪松、柴麗華）；110016 沈陽，沈陽藥科大學中藥學院（李寧）

考察 Tortoside A（TOA）對人宮頸癌 SiHa 細胞增殖和凋亡的影響及可能機制。以 CCK-8 法、流式細胞術等檢測 TOA 對人宮頸癌細胞增殖抑制作用、對細胞凋亡水平和細胞周期的影響，Western blot 法檢測 TOA 對 SiHa 細胞凋亡相關蛋白表達的影響。TOA 通過作用于Caspase、Bcl-2 家族蛋白而誘導細胞發(fā)生了凋亡，并使細胞停滯于 G1 期，降低腫瘤細胞的增殖活性。TOA 對 SiHa 細胞的增殖具有抑制作用，其抑制作用可能與促進細胞凋亡有關。

TOA； SiHa 細胞； 增殖； 凋亡

駱駝刺 Alhagi sparsifolia shap. 為豆科駱駝刺屬植物，是新疆干旱沙漠地區(qū)特有的一種植物，落葉灌木，耐旱、耐高溫、抗風沙是它的特性[1-3]。課題組前期已對駱駝刺進行了初步研究[4-8]，證實駱駝刺提取物具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[9-10]，對小鼠實體瘤模型具有一定的敏感性，抑瘤率達到 24.8%。經(jīng)過系統(tǒng)分離有效部分中的化學成分，發(fā)現(xiàn)其中 Tortoside A（TOA）的含量較高[11-12]，有理由推測 TOA 可能是駱駝刺的主要有效成分之一。為了深入探討駱駝刺中分離得到的 TOA 對腫瘤細胞的影響，本研究通過體外培養(yǎng)人宮頸癌 SiHa 細胞，采用體外細胞培養(yǎng)技術、流式細胞術及多種分子生物學技術觀察 TOA 對宮頸癌 SiHa 細胞增殖、凋亡的影響，并探討其發(fā)生機制，為未來開發(fā)利用駱駝刺資源提供實驗依據(jù)，同時對尋找新的抗癌藥物，充分挖掘利用新疆維吾爾藥資源是一項非常有意義的工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 TOA（結構如圖1 所示）由沈陽藥科大學李寧教授提供，經(jīng) HPLC 面積歸一法純度約為 98.1%，用 DMSO 溶解，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 TOA 結構

Figure 1 The structure of TOA

1.1.2 細胞 SiHa 人宮頸癌細胞株來源于凱基生物。

1.1.3 試劑 胎牛血清（FBS）為依科賽生物產(chǎn)品；DMEM（高糖）培養(yǎng)基（C11965500BT）為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；Cell Counting Kit-8 細胞增殖/毒性檢測試劑盒（FC101-03）、TransZol Up（ET111）、Easy II Protein Quantitative Kit (BCA)（DQ111-01）均為全式金生物產(chǎn)品；Giemsa 染液（D010）為南京建成公司產(chǎn)品；順鉑（P4394-25MG）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；5X All-In-One RT MasterMix（G492）為 Abm 公司產(chǎn)品；QuantiNava SYBRGreen Kit（208054）為凱捷公司產(chǎn)品；RIPA 裂解液（AR0105）為博士德公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱和生物安全柜均購自上海力康儀器有限公司；Eclipse TS100-F 熒光倒置顯微鏡購自日本尼康公司；xMarkTM酶標儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、PCR 儀均購自美國 Bio-Rad 公司；LSR II 流式細胞儀購自 BD 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；實時熒光 PCR 儀購自美國 ABI 公司；Chemiscope 3000 化學發(fā)光成像儀系統(tǒng)購自上海勤翔科學儀器有限公司；DYCZ-24DN 電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的細胞，立刻置于 37 ℃水浴中，快速晃動凍存管，2 min 內(nèi)使細胞快速解凍，將解凍后的細胞快速加入提前加有 9 ml 完全培養(yǎng)基的 15 ml 離心管中，離心棄上清，將細胞接種到培養(yǎng)瓶中，37 ℃、飽和濕度、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 2 ~ 3 天傳代一次。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞存活率 取生長狀態(tài)良好，匯合率達 90% 的 SiHa 細胞，完全培養(yǎng)基制備成 5 × 104個/ml 單細胞懸液，接種至 96 孔板中（100 μl/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入 100 μl TOA（2.5、5、10、20、40、80 μg/ml）藥物，同時設置空白對照組（加入與實驗組相當?shù)?DMSO 溶劑），每組 5 個重復，放入培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。分別干預 48 h 后，每孔加入培養(yǎng)基總體積 10% 的 CCK-8，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育，1 h 后用酶標儀測定 450 nm 處的值，根據(jù)細胞存活率計算 IC50值。為捕捉細胞的凋亡信號，避免非凋亡性殺傷細胞過多，故在接下來的試驗中將藥物干預的高、低劑量分別設置為1/2 IC50值和 1/4 IC50值。

1.2.3 細胞克隆形成能力的影響 參考 Lin 等[13]的實驗方法，收集生長狀態(tài)良好匯合率達90% 的 SiHa 細胞，用完全培養(yǎng)基制成密度為 100 個/ml 的單細胞懸液，按 200 個/孔接種到 6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng) 24 h 貼壁后，以不同濃度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和順鉑干預 24 h，每組設 3 個復孔。15 d 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 2 次，4% 的甲醛室溫固定 20 min，PBS 洗 2 次，每孔加入 500 μl 的 Giemsa 染液 A 液，室溫染色 1 min，不棄去 A 液，加入 1 ml Giemsa 染液 B 液，繼續(xù)染色 5 min，棄去染色液，PBS 洗 3 次，晾干后拍照計數(shù)。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取生長狀態(tài)良好匯合率達 90% 的 SiHa 細胞，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基制成密度為 5 × 104個/ml 的單細胞懸液，接種到 6 孔板中（2 ml/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，以不同濃度 TOA 和順鉑進行干預，每組 3 個復孔。干預 48 h 后將培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)（內(nèi)含已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞），PBS 洗滌貼壁細胞兩次，將 PBS 一并收集至離心管內(nèi)，胰酶消化細胞，將細胞轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000 r/min 離心 5 min，棄上清。用預冷的 PBS 洗滌 2 遍，棄干凈上清。加入 400 μl AnnexinV 結合液重懸細胞，過 200 目篩網(wǎng)，制成單細胞懸液。加入 5 μl AnnexinV-FITC，輕輕混勻，4 ℃避光孵育 15 min。再加入 10 μl PI 染色液，輕輕混勻，4 ℃避光放置 5 min。在 30 min 內(nèi)進行流式細胞儀檢測，AnnexinV-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期 取生長狀態(tài)良好匯合率達 90% 的 SiHa 細胞，胰酶消化，用完全培養(yǎng)基制成密度為 5 × 104個/ml 的單細胞懸液，接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，以不同濃度 TOA 和順鉑進行干預 48 h，每組 3 個復孔。胰酶消化干預后的細胞，用 5 ml 的 PBS 洗一遍，用 500 μl 預冷 PBS 重懸細胞，將細胞懸液加入到 3.5 ml 預冷的 80% 乙醇中，4 ℃固定過夜。2500 r/min 離心 5 min，沉淀細胞。小心吸除上清，以避免吸走細胞。用預冷的 PBS 洗滌 2 遍，棄干凈上清。加入 500 μl PI/RNase Staining Buffer 重懸細胞，過 200 目尼龍篩網(wǎng)，制成單細胞懸液。4 ℃避光孵育 30 min。用流式細胞儀在激發(fā)波長 488 nm 處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。分析軟件進行細胞 DNA 含量分析和光散射分析。

1.2.6 JC-1 測定線粒體膜電位 將 SiHa 細胞，完全培養(yǎng)基制備成 5 × 104個/ml 單細胞懸液，以 2 ml/孔接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基，以不同濃度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和順鉑干預 48 h，每組 3 個復孔。胰酶消化各組細胞，離心棄上清，用 1 ml PBS 重懸細胞于 1.5 ml 離心管中，離心吸掉上清。用0.5 ml JC-1 工作液重懸細胞，于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育 15 min。400 ×離心 5 min，棄去上清，用 1 ml PBS 洗滌細胞 2 次，之后離心，吸掉上清，用 0.5 ml PBS 重懸細胞，過 200 目篩網(wǎng)，30 min 內(nèi)進行流式細胞儀檢測分析。

1.2.7 Hoechst 染色檢測細胞凋亡情況 將 SiHa 細胞，完全培養(yǎng)基制備成 5 × 104個/ml 單細胞懸液，接種到 6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 24 h 貼壁后，棄去培養(yǎng)基，以不同濃度（1/2 IC50值和 1/4 IC50值）TOA 和順鉑進行干預，每組 3 個復孔。干預 48 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 2 次，4% 的多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 2 次，每孔加入 500 μl 的 Hoechst 染色液，室溫染色 5 min，棄去染色液，PBS 洗 2 次，在顯微鏡下激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長參數(shù)為 460 nm 時，觀察細胞凋亡情況。

1.2.8 Western blot 檢測凋亡蛋白的表達 參考朱晗清和高豐厚[14]的試驗方法，用不同濃度的 TOA 處理 SiHa 細胞 24 h，使用 RIPA 裂解液和 PMSF（RIPA:PMSF = 100:1）從 SiHa 細胞中提取總蛋白。用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。通過 10% SDS-聚丙烯酰胺電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉在室溫下封閉 1 h。然后在 4 ℃條件下進行一抗孵育過夜，TBST 清洗 3 次，膜與兔抗/鼠抗在室溫調(diào)節(jié)下孵育 1 h，再用 TBST 清洗 3 次，最后用ChemiScope mini 化學發(fā)光儀檢測、拍照，并對各蛋白條帶的灰度值進行分析，將β-actin 作為內(nèi)參，用目的條帶與β-actin 條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 TOA 對 SiHa 細胞增殖抑制率的影響

由表1 可知，TOA 高濃度組存活率低于低濃度組，呈明顯的劑量依賴關系，差異具有統(tǒng)計學意義（< 0.05）?；衔?TOA 對 SiHa 細胞的生長抑制作用呈濃度和時間依賴性。

2.2 克隆形成實驗結果

細胞克隆實驗可定量分析單個細胞的增殖潛力，清楚細胞的增殖和獨立生存能力[14]。分別用不同濃度藥物處理 SiHa 細胞后，檢測細胞的克隆形成能力[15]。從圖2中，我們可以明顯觀察出藥物干預的細胞同空白組相比，細胞克隆形成的明顯較少。其定量分析結果見表2 所示：同空白組比較，化合物 TOA 干預細胞后，形成的克隆數(shù)量明顯減少（< 0.05）。

表1 TOA 對細胞增殖抑制率及 IC50值的影響（，n = 5）

注：*與空白對照組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

圖2 TOA 對 SiHa 細胞克隆形成作用

Figure 2 Effect on SiHa cells clone formation of TOA

表2 不同濃度 TOA 對 SiHa 細胞克隆形成的作用（，n = 3）

注：*與空白組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

圖3 TOA 作用于 SiHa 細胞 Hoechst 染色圖片

Figure 3 Effect of TOA on colony formation in SiHa cells

圖4 SiHa 細胞線粒體膜電位檢測流式圖

Figure 4 Effect of TOA on depolarization of mitochondrial membrane potential in SiHa cells

2.3 Hoechst 染色實驗結果

誘導腫瘤細胞凋亡是評價抗腫瘤藥物療效的主要指標之一，本試驗通過 Hoechst 染色，在顯微鏡下觀察經(jīng) TOA 處理后的 SiHa 細胞凋亡發(fā)生的程度。實驗結果如圖3所示，熒光顯微鏡下觀察，TOA 高劑量組出現(xiàn)致密濃染的顆粒狀熒光，可見細胞熒光明顯增強，部分出現(xiàn)高染，細胞核固縮、碎裂增多以及部分可見細胞核中染色體匯集于兩端，呈典型的凋亡特征，由此可見 TOA 能顯著促進 SiHa 細胞凋亡。

2.4 線粒體膜電位檢測結果

腫瘤細胞線粒體膜電位的降低是腫瘤細胞早期凋亡的特征之一，故本試驗采用 JC-1 染色，以流式細胞儀檢測經(jīng) TOA 處理后的 SiHa 細胞的線粒體膜電位[16]。在圖4的象限中可觀察到膜電位降低的變化。其定量分析結果如表3 所示，與空白組比較，TOA 高、低劑量組處理 SiHa 細胞 48 h 后，其線粒體膜電位下降比率分別達到（14.500 ± 0.755）% 和（12.847 ± 0.404）%，有顯著差異（< 0.01）。

表3 流式檢測 TOA 對 SiHa 細胞線粒體膜電位的作用（，n = 3）

注：*與空白組比較，< 0.01。

Note:*Compared with control group,< 0.01.

圖5 TOA 作用于 SiHa 細胞凋亡檢測流式圖

Figure 5 Effect on apoptosis of SiHa cells by flow cytometry

2.5 細胞凋亡檢測結果

Annexin V-FITC/PI 染色后，可標示處于正常細胞群、早期凋亡細胞、晚期凋亡和壞死細胞等不同細胞群[16]。如圖5 所示，TOA 作用 48 h后，可顯著誘導 SiHa 細胞發(fā)生凋亡，而隨著 TOA濃度增加，細胞凋亡率也有所增加，統(tǒng)計結果見表4。

2.6 細胞周期檢測結果

實驗結果如圖6、圖7所示，作用 48 h 后，TOA 可使 SiHa 細胞 G0/G1 期細胞所占的百分比增加，提示 TOA 可使細胞均阻滯于 G1 期，所以我們認為 TOA 對于細胞的阻滯是發(fā)生在G1 期的。

表4 流式檢測 TOA 對 SiHa 細胞凋亡的作用（，n = 3）

注：*與空白組比較，< 0.05。

Note:*Compared with control group,< 0.05.

圖6 SiHa 細胞周期檢測流式圖

Figure 6 The flow chart of SiHa cells cycle detected by TOA intervention

圖7 TOA 干預 SiHa 細胞周期作圖

Figure 7 Effect on apoptosis of SiHa cells

圖8 Western blot 實驗條帶圖及柱狀圖

Figure 8 The chart of Western blot experiment

2.7 Western blot 實驗結果

如圖8 所示，TOA 作用于 SiHa 細胞 24 h 后，與對照組相比，Caspase-3 和Caspase-7 表達增加，同時Caspase-3 的底物 PARP 蛋白被剪切活化，亦顯著降低 Bcl-2 的表達。說明 TOA 誘導宮頸癌細胞的凋亡可能與 Caspase 家族有關。

3 討論

駱駝刺 Alhagi sparsifolia shap. 為豆科駱駝刺屬植物，在本研究中，我們首先考察了 TOA 對人宮頸癌細胞 SiHa 的增殖抑制作用。結果顯示，TOA 對細胞的增殖抑制作用較強。繼而通過流式細胞術檢測細胞凋亡率可以得出這樣的結論：TOA 能夠誘導 SiHa 細胞發(fā)生凋亡。

當細胞發(fā)生凋亡時，死亡信號通過細胞表面的信號分子傳遞到Caspase-7 并將其激活，繼而引起Caspase-3 的激活，誘導凋亡[17-18]。Western blot 的結果顯示，TOA 作用后能使Caspase-3 和 Caspase-7 的表達上調(diào)，使細胞中 Bcl-2 表達下調(diào)，同時剪切Caspase-3 的底物 PARP。推測 TOA 誘導宮頸癌細胞的凋亡可能與 Caspase、Bcl 家族有關。細胞增殖和凋亡水平的改變常與細胞周期調(diào)控的變化有關。細胞周期沿著 G1、S、G2、M 期的順序運轉(zhuǎn)[19]。G1 期是啟動細胞周期循環(huán)的關鍵，其運轉(zhuǎn)狀態(tài)是多種疾病的發(fā)病基礎，也是藥物發(fā)揮治療作用的切入點[20]。本實驗顯示，TOA 可以使宮頸癌細胞停滯于 G1 期，阻止其向 S 期及 M 期轉(zhuǎn)化，從而使腫瘤細胞生長緩慢并降低其增殖活性。因此，TOA 誘導宮頸癌細胞發(fā)生了凋亡，并使細胞停滯于 G1 期，降低腫瘤細胞的增殖活性。TOA 可以作為一個潛在抗宮頸癌藥物先導化合物，對其作用機制做進一步的研究。

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Tortoside A induces apoptosis of human cervical cancer cells and affects cell cycle in the initial research

MA Xiao-ling, LIU Xue-song, CHAI Li-hua, CHEN Gang, LI Ning, WEI Hong-yan

Author Affiliations:Xinjiang Institute of Chinese Medicine and Medicine of National, Urumqi 830002, China (MA Xiao-ling, LIU Xue-song, CHAI Li-hua, CHEN Gang, WEI Hong-yan); College of Life Sciences and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China (LIU Xue-song, CHAI Li-hua); School of Traditional Chinese Medicine, Shenyang Pharmaceutical University, Shen Yang 110016, China (LI Ning)

The possible mechanism on the proliferation and apoptosis of human cervical cancer cells effected by TOA was investigated.The CCK-8 method was used to detect the inhibitory effect of TOA on the proliferation of human cervical cancer cells, the apoptosis level and cell cycle of cervical cancer cells detected by flow cytometry, the related protein expression apoptosis of cervical cancer cells were detected by Western blot.TOA induced apoptosis of cervical cancer cells by acting on Caspase and Bcl-2 family proteins, and arrested the cells in the G1 phase, reducing the proliferation activity of tumor cells.TOA has an inhibitory effect on the proliferation of cervical cancer cells, and its inhibitory effect may be related to the promotion of cell apoptosis.

TOA; SiHa cell; proliferation; apoptosis

WEI Hong-yan, Email: whywlmq@sina.com

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金（2018D01B12）

魏鴻雁，Email：whywlmq@sina.com

2020-11-20

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.007