嗜熱脂肪芽胞桿菌色氨酰-tRNA合成酶BsTrpRS的表達(dá)、純化及其與創(chuàng)新霉素復(fù)合物的單晶制備和X-射線衍射分析

樊帥，呂廣新，金媛媛，楊兆勇

·論著·

嗜熱脂肪芽胞桿菌色氨酰-tRNA合成酶BsTrpRS的表達(dá)、純化及其與創(chuàng)新霉素復(fù)合物的單晶制備和X-射線衍射分析

樊帥，呂廣新，金媛媛，楊兆勇

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物代謝工程室

獲得來(lái)源于嗜熱脂肪芽胞桿菌色氨酰-tRNA 合成酶（BsTrpRS）與創(chuàng)新霉素復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，為創(chuàng)新霉素的理性設(shè)計(jì)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)獲得 BsTrpRS 可溶性表達(dá)，采用親和層析色譜、離子交換色譜和分子排阻色譜純化目的蛋白，以期獲得純度在 90% 以上的 BsTrpRS，通過(guò)等溫滴定量熱法檢測(cè) BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素的親和力。選用懸滴-水蒸汽擴(kuò)散法篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶條件，通過(guò)優(yōu)化結(jié)晶條件獲得高質(zhì)量晶體，利用上海光源蛋白質(zhì)晶體學(xué)光束線站收集 X-ray 衍射數(shù)據(jù)。運(yùn)用分子生物學(xué)方法成功構(gòu)建含基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 BL21(DE3) 得到重組表達(dá)菌株。運(yùn)用親和層析、離子交換色譜和分子排阻色譜等蛋白純化技術(shù)，獲得高純度 BsTrpRS 蛋白。利用 ITC 技術(shù)確證創(chuàng)新霉素與 BsTrpRS 之間親和力為 3.2 μmol/L。通過(guò)晶體篩選優(yōu)化，最佳結(jié)晶條件為 1.8 mol/L K2HPO4，pH 7.6，37 ℃，0.75%（v/v）1,3-丙二醇，最終獲得 X-ray 衍射分辨率為 2.06 ?的 BsTrpRS/創(chuàng)新霉素二元復(fù)合物晶體，其晶胞參數(shù)為 a = 91.675 ?，b = 91.675 ?，c = 152.37 ?，α = 90.000°，β = 90.000°，γ = 120.000°，晶體的馬修斯系數(shù)為 2.48 ?3/Da，最小非對(duì)稱單位內(nèi)含有 2 個(gè)蛋白分子，溶劑百分比為 50.46%。創(chuàng)新霉素與 BsTrpRS 復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的獲得，有望對(duì)創(chuàng)新霉素小分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化及設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)方向及重要依據(jù)。

創(chuàng)新霉素； 色氨酰-tRNA合成酶； 共結(jié)晶； X-射線衍射

細(xì)菌耐藥己經(jīng)成為21 世紀(jì)全球面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)之一，尤其革蘭氏陽(yáng)性菌出現(xiàn)了非常嚴(yán)重的耐藥性[1]，如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、耐青霉素肺炎鏈球菌及耐萬(wàn)古霉素的腸球菌；細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有藥物的耐藥速度己經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)新藥的研發(fā)速度，從而促使惡性循環(huán)進(jìn)一步加劇。與現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的藥物結(jié)構(gòu)不同，噻喃并吲哚結(jié)構(gòu)母核的化合物創(chuàng)新霉素（chuangxinmycin）[2-3]具有抗耐藥菌活性和抗結(jié)核桿菌活性，具有發(fā)展成為一類新母核結(jié)構(gòu)的抗菌藥物的潛力。

創(chuàng)新霉素的抗菌作用是通過(guò)選擇性抑制色氨酰 tRNA 合成酶（tryptophanyl-tRNA synthetase，TrpRS）[4-5]活性實(shí)現(xiàn)的。氨酰 tRNA 合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases，aaRSs）催化氨基酸酰胺化與相應(yīng) tRNA 結(jié)合生成酰胺氨基酸 tRNA，在核苷酸的翻譯過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。此類酶的活性和選擇性是生命所必需的。作為蛋白質(zhì)翻譯必需的酶，氨酰 tRNA 合成酶是理想的抗菌藥物靶點(diǎn)[6]，但必須要注意氨酰 tRNA 合成酶物種間的特異性，以避免對(duì)人類產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。以氨酰 tRNA 合成酶作為靶點(diǎn)最成功的例子為莫匹羅星，它的作用靶點(diǎn)為IleRS，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合異亮氨酸和 ATP 的結(jié)合抑制 IleRS 的活性[7]，可治療金黃色葡萄球菌感染。創(chuàng)新霉素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究人員就對(duì)其進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)確證、生物合成、化學(xué)合成、藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)等大量的研究[8-11]。但由于目前關(guān)于創(chuàng)新霉素和 TrpRS 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道，分子機(jī)制尚不清楚，至今仍未廣泛應(yīng)用于臨床。

本研究主要對(duì)嗜熱脂肪芽胞桿菌色氨酰-tRNA 合成酶（BsTrpRS）與創(chuàng)新霉素的復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，構(gòu)建 BsTrpRS 原核表達(dá)載體，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行BsTrpRS 蛋白的異源表達(dá)，經(jīng) Co2+親和層析、離子交換層析和分子篩純化后，對(duì) BsTrpRS 進(jìn)行晶體培養(yǎng)獲得 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素的復(fù)合物晶體，應(yīng)用生物大分子 X-ray 衍射技術(shù)獲得復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)并進(jìn)行解析，為創(chuàng)新霉素的理性設(shè)計(jì)與結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供理論依據(jù)，指導(dǎo)開(kāi)發(fā)新的具有更好活性的抗菌藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 BsTrpRS 表達(dá)菌株BL21(DE3) 和表達(dá)質(zhì)粒 pET-21a(+) 購(gòu)自美國(guó) Novagen 公司；Co2+-NTA 填料購(gòu)自日本 Takara 公司；30 K 超濾濃縮管購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；HiTrap DEAE HP 和 Superose 12 10/300GL 購(gòu)自美國(guó) Cytiva 公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 恒溫?fù)u床購(gòu)自英國(guó) New Brunswick 公司；PCR 儀購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems 公司；MicroCal PEAQ-ITC 等溫滴定量熱儀購(gòu)自英國(guó) Malvern Panalytical 公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 BsTrpRS 蛋白序列（WP_033015631.1）經(jīng)優(yōu)化密碼子使其適于大腸桿菌表達(dá)，人工合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的基因序列。利用其基因序列為模板，設(shè)計(jì) PCR 引物，分別為：NdeI-BsTrpRS-F（5' GGAATTCAA AACCATTTTTAGCGGCATTC 3'）（下劃線部分為加入的I 酶切位點(diǎn)），XhoI-BsTrpRS-R（5' CC GGGCTATGGGTCTGGGTCGTCGCCGC3'）（下劃線部分為加入的I 酶切位點(diǎn)），經(jīng) PCR 擴(kuò)增和I/I 雙酶切處理后，連入已I/I 雙酶切 pET-21a(+) 構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒 pET-21BsTrpRS，利用基因測(cè)序確認(rèn)序列準(zhǔn)確無(wú)誤。

1.2.2 BsTrpRS 表達(dá)與純化 將 pET-21BsTrpRS 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3) 表達(dá)菌株接種于 1 L 含 100 μg/ml Amp 的 LB 培養(yǎng)基中。37 ℃，200 r/min 恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)至6000.8 ～ 1.0，加入終濃度為 0.5 mmol/L IPTG，200 r/min 20 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng) 12 h。收集誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體在 4 ℃、5000 r/min條件下離心 10 min，棄上清，用 Lysis buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 7.4）重懸，利用高壓均質(zhì)機(jī)破碎，在 4 ℃、18 000 r/min 條件下離心 30 min，收集上清備用。由于 pET-21a(+) 帶有 His6標(biāo)簽，因此可選用 Co2+-NTA 柱特異性吸附從而進(jìn)行蛋白純化，首先將收集的上清用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，然后與經(jīng) Lysis buffer 平衡后的基質(zhì)在 4 ℃下結(jié)合 1 h，再用 Washing buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，pH 7.4）5 倍柱體積沖洗，最后用 Elution buffer（20 mmol/L 磷酸緩沖液，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫目的蛋白。離子交換層次采用弱陰離子交換柱 HiTrap DEAE HP，利用洗脫液（20 mmol/L Tris 和 2 mol/L NaCl，pH 8.0）進(jìn)行梯度洗脫，收集出峰樣品經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)后，將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管進(jìn)行脫鹽濃縮后備用。分子排阻層析流速為0.5 ml/min，收集出峰樣品經(jīng) SDS-PAGE 檢測(cè)后將目的蛋白用 30 K 超濾濃縮管進(jìn)行脫鹽濃縮后備用。

1.2.3 BsTrpRS 結(jié)晶條件優(yōu)化 根據(jù)前期報(bào)道的 BsTrpRS 結(jié)晶條件[12]進(jìn)行BsTRpRS 和創(chuàng)新霉素復(fù)合物晶體的結(jié)晶，將 BsTrpRS 濃度調(diào)至 8 mg/ml，創(chuàng)新霉素濃度 1.5 mmol/L，以 K2HPO4溶液作沉淀劑，在 16 孔板中用不同濃度的 K2HPO4，pH 7.6 作為池液，將 BsTrpRS 與池液 1:1 混合懸滴，樣品放于 23 ℃恒溫培養(yǎng)箱，采用懸滴-蒸汽擴(kuò)散法培養(yǎng)晶體。對(duì)觀察有晶體出現(xiàn)條件的 pH、蛋白濃度、結(jié)晶溫度和沉淀劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得可用于收集 X-射線衍射數(shù)據(jù)的單晶體。

1.2.4 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素親和力評(píng)價(jià) ITC 實(shí)驗(yàn)由 MicroCal PEAQ-ITC 完成，配置 300 μl 濃度 20 μmol/L BsTrpRS 加入樣品池，每隔 180 s 滴定體積為 2 μl 濃度為 150 μmol/L 的創(chuàng)新霉素溶液，樣品池溫度為 37 ℃，滴定針數(shù)為 20 滴，數(shù)據(jù)用 MicroCal PEAQ-ITC 自帶的 Origin 7.0 進(jìn)行積分，采用 One Set of Sites 模型按照非線性最小方差法擬合滴定反應(yīng)熱。

1.2.5 X-Ray 晶體衍射與數(shù)據(jù)收集 經(jīng)凍存的晶體在上海同步輻射光源BL18U1（0.97915 ?）線站上收集數(shù)據(jù)，使用檢測(cè)器 Pilatus3 6M 收集衍射數(shù)據(jù)，衍射數(shù)據(jù)使用 HKL3000 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)還原。

2 結(jié)果

2.1 BsTrpRS 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì) BsTrpRS 基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，保持氨基酸序列不變的情況下，優(yōu)化核苷酸序列使其適于大腸桿菌表達(dá)，改造完成后的基因序列由華大基因進(jìn)行全基因合成，密碼子優(yōu)化前后的基因序列對(duì)比如圖1 所示。

將密碼子優(yōu)化后的作為模板（以下出現(xiàn)的均為密碼子優(yōu)化后的序列），以NdeI-BsTrpRS-F 和 XhoI-BsTrpRS-R 為引物，進(jìn)行PCR 克隆目的基因，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，的基因序列理論長(zhǎng)度為 984 bp。結(jié)果如圖2 所示，在約 1000 bp 處有特異性條帶，與基因序列理論長(zhǎng)度相符。

2.2 BsTrpRS 異源表達(dá)與純化

通過(guò)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，成功表達(dá)全長(zhǎng)的 BsTrpRS 重組細(xì)菌。在 37 ℃、200 r/min的條件下，培養(yǎng)至600達(dá)到 0.8 ～ 1.0，加入終濃度為 0.2 mmol/L的 IPTG，在 20 ℃、12 h 條件下誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。收集菌體，經(jīng)高壓破碎，18 000 r/min 離心后，取上清過(guò) 0.45 μm 濾膜，采用 TALON?Metal Affinity Resin 進(jìn)行第一步親和層析純化，目的蛋白第二步純化利用弱陰離子交換柱 HiTrap DEAE HP 進(jìn)行純化，BsTrpRS 蛋白在洗脫液（20 mmol/L Tris，2 mol/L NaCl，pH 8.0）梯度洗脫，收集出峰樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖3 所示。經(jīng)離子交換純化后，BsTrpRS 純度較高，達(dá) 90% 以上，為保證蛋白的均一性，目的蛋白第三步純化采用分子排阻色譜 Superose 12 10/300GL 進(jìn)行純化，分子篩緩沖液為 50 mmol/L Tris，pH 7.2，0.1 mmol/L PMSF，收集出峰樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖4 所示。分子排阻色譜純化后，BsTrpRS 純度進(jìn)一步提高，收集均一性較好的峰尖處蛋白，濃縮后備用。

圖1 適于大腸桿菌表達(dá)的bstrprs序列密碼子優(yōu)化前后比對(duì)（BsTrpRS-before：優(yōu)化前序列；BsTrpRS-after：優(yōu)化后序列）

Figure 1 Comparison of wild-type and optimizedgene sequence forexpression (BsTrpRS-before: Wild-type LpxC gene sequence; BsTrpRS-after: Optimized LpxC gene sequence forexpression)

M：核酸標(biāo)準(zhǔn)品；1：基因

M: Marker ; 1:gene

圖2基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

Figure 2 PCR amplification results ofgene

M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；1 ～ 7：BsTrpRS

M: Protein marker; 1 - 7: BsTrpRS

圖3 弱離子交換純化BsTrpRS 的SDS-PAGE 分析

Figure 3 SDS-PAGE analysis of BsTrpRS purified by DEAE ion-exchange chromatography

2.3 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素復(fù)合物的結(jié)晶

對(duì)初篩條件中的 pH、蛋白濃度、沉淀劑濃度、結(jié)晶溫度和添加劑進(jìn)行優(yōu)化，最終在蛋白濃度為 5.5 mg/ml，池液條件為 1.8 mol/L K2HPO4，pH 7.6，結(jié)晶溫度為 37 ℃，添加劑為 1,3-丙二醇（0.75% v/v）時(shí)，結(jié)晶條件最優(yōu)，晶體如圖5 所示。將優(yōu)化后的晶體液氮凍存，用 X 射線衍射儀篩選衍射分辨率較高的晶體，經(jīng)液氮保存后，送至上海光源（SSRF）BL18U1 線站采集數(shù)據(jù)，衍射具體參數(shù)為：波長(zhǎng)0.97915 ?，掃描步長(zhǎng)為 1°，曝光時(shí)間 0.5 s，檢測(cè)器距離 350 mm，收集 360 張衍射圖（圖6），并使用 HKL3000 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)數(shù)據(jù)還原，確定 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)空間群為3121（或3221）。衍射數(shù)據(jù)的分辨率為 2.06 ?，晶胞參數(shù)為：a = 91.675 ?，b = 91.675 ?，c = 152.37 ?，α = 90.000°，β = 90.000°，γ = 120.000°。衍射數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表 1。

M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；泳道1 ～ 4：BsTrpRS

M: Protein marker; 1 - 4: BsTrpRS

圖4 分子排阻色譜純化BsTrpRS 的SDS-PAGE 分析

Figure 4 SDS-PAGE analysis of BsTrpRS purified by size exclusion chromatography

圖5 BsTrpRS/創(chuàng)新霉素復(fù)合體晶體（× 64）

Figure 5 The crystal of chuangxinmycin in complex with BsTrpRS (× 64)

圖6 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素復(fù)合物晶體 X 射線衍射圖（最大分辨率為 2.06 ?）

Figure 6 Crystal X-ray diffraction pattern of BsTrpRS- chuangxinmycin complex (shown at 2.06 ? resolution)

表 1 BsTrpRS/創(chuàng)新霉素晶體數(shù)據(jù)

注：括號(hào)內(nèi)為最外殼層數(shù)據(jù)。

Note: Values in parentheses refer to the highest resolution shells.

圖7 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素相互作用的產(chǎn)生的 ITC 圖譜

Figure 7 ITC raw data and binding isotherm for chuangxinmycin interacting with the BsTrpRS

2.4 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素親和力評(píng)價(jià)

利用 ITC 檢測(cè)創(chuàng)新霉素與 BsTRpRS 的相互作用，結(jié)果如圖7 所示。通過(guò)對(duì)反應(yīng)熱函數(shù)用 One Set of Sites 模型進(jìn)行擬合，得到創(chuàng)新霉素與 BsTrpRS 的結(jié)合常數(shù)、焓變和熵變，創(chuàng)新霉素與 BsTrpRS 的結(jié)合親和力在微摩爾數(shù)量級(jí)，為3.2 μmol/L，根據(jù)結(jié)合熱力學(xué)特性表明，創(chuàng)新霉素與 BsTrpRS 的結(jié)合是放熱反應(yīng)，其中 ?H 為–13.5 kcal/mol，–T?S 為 6.0 kcal/mol，因此氫鍵是介導(dǎo)創(chuàng)新霉素與 BsTrpRS 結(jié)合的主要作用力。這些分子互作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明獲得的結(jié)晶中的分子為 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素的復(fù)合體。

3 討論

TrpRS 在生物體內(nèi)的主要作用是催化 ATP 活化 Trp 并轉(zhuǎn)移至 tRNA，確保色氨酸遺傳密碼的翻譯。TrpRS 對(duì)其底物 Trp 和 tRNA 的特異性識(shí)別對(duì)于維持蛋白質(zhì)合成的保真度至關(guān)重要。來(lái)源于的 BsTrpRS 的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，其含有兩個(gè)高度保守特征序列的 RF 結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)保守特征序列即為 KMSKS（Lys-Met-Ser-Lys- Ser）和 HIGH（His-Ile-Gly-His）。KMSKS 有助于氨基酸活化，HIGH 在氨基酸活化期間穩(wěn)定 ATP 并使氨基酸轉(zhuǎn)移的 tRNA 的 3' 端，C 末端α 螺旋結(jié)構(gòu)域是 tRNA 反密碼子的結(jié)合位點(diǎn)。作為蛋白質(zhì)翻譯必需的酶，TrpRS 是理想的抗菌藥物靶點(diǎn)。創(chuàng)新霉素是游動(dòng)放線菌產(chǎn)生的具有全新結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物，其抑制活性具有物種選擇性，對(duì)細(xì)菌來(lái)源的 TrpRS 的親和力是哺乳動(dòng)物源的上千倍，故創(chuàng)新霉素是極具潛力的新靶點(diǎn)抗生素先導(dǎo)物。由于目前關(guān)于創(chuàng)新霉素和 TrpRS 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道，分子機(jī)制尚不清楚。從發(fā)現(xiàn)至今，創(chuàng)新霉素的研究進(jìn)展緩慢，至今仍未廣泛應(yīng)用于臨床。本文利用大腸桿菌異源表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)來(lái)自的BsTrpRS 的大量表達(dá)。采用 Co2+親和層析、離子交換和分子排阻色譜等得到可用培養(yǎng)結(jié)晶的高純度的樣品。ITC 實(shí)驗(yàn)證明 BsTrpRS 與創(chuàng)新霉素可以形成穩(wěn)定的復(fù)合體，利用共結(jié)晶法可培養(yǎng) BsTrpRS/創(chuàng)新霉素復(fù)合體的單晶，為下一步解析BsTrpRS/創(chuàng)新霉素復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)，抑制機(jī)制和理性設(shè)計(jì)藥物先導(dǎo)物打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Prokaryotic expression and purification of tryptophanyl-tRNA synthetase fromand preliminary crystallographic study on its complex with chuagnxinmycin

FAN Shuai, LYU Guang-xin, JIN Yuan-yuan, YANG Zhao-yong

Author Affiliation: Department of Microbial Pathway Engineering, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050,China

Solving the crystal structure of Tryptophanyl-tRNA Synthetase (BsTrpRS) fromin complex with chuangxinmycin will provide us more insight into the function of chuangxinmycin in physiology and pharmacology, and also help us design and optimize the chuangxinmycin-based drugs.The soluble expression of BsTrpRS protein was obtained byexpression system. The target protein was purified by affinity chromatography, ion exchange chromatography and molecular size exclusion chromatography in order to obtain BsTrpRS, with purity of more than 90%. The binding affinity between BsTrpRS and chuangxinmycin was evaluated using isothermal titration calorimetry analysis. High quality crystal for X-ray diffraction was obtained on the protein crystallography beamline (BL18U1) at the Shanghai Synchrotron Radiation Facility by employing vapor diffusion suspension method.The recombinant plasmid containinggene was successfully constructed by molecular biological method, and the strain BL21 (DE3) with high expression of BsTrpRS protein was obtained by optimization. High purity BsTrpRS protein was obtained by affinity chromatography, ion exchange chromatography and molecular size exclusion chromatography. The binding affinity of the BsTrpRS/chuangxinmycin was 3.2 μmol/L. The complex crystals of BsTrpRS and chuangxinmycin was obtained at ptimum conditions (1.8 mol/L K2HPO4, 0.75% v/v 1,3-propylene glycol, pH 7.6, 37 ℃), and the resolution of diffraction data up to 2.06 ?. The Matthews coefficient of the crystal is 2.48 ?3/Da, which corresponds to nearly 50.46% solvent content with two subunits of BsTrpRS protein in the asymmetric unit.The crystal structure of BsTrpRS with chuangxinmycin is expected to provide guidance and basis for the optimization and design of small molecular analogues of chuangxinmycin.

chuangxinmycin; tryptophanyl-tRNA synthetase; co-crystallization; X-ray diffraction

YANG Zhao-yong, Email: zhaoyongy@imb.pumc.edu.cn

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2019-I2M- 1-005）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81872782）

楊兆勇，Email：zhaoyongy@imb.pumc.edu.cn

2020-12-15

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.005