微孔板式微生物法與國標(biāo)微生物法測定 嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的比較

◎ 郭瑩瑩，楊 光，李興霖，王玉芝，王哲明，趙 平

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

泛酸屬于水溶性維生素，在體內(nèi)主要以輔酶A形式參與代謝。泛酸是人、動(dòng)物及微生物必需的營養(yǎng)物質(zhì)，作為營養(yǎng)添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品中[1-3]。泛酸缺乏時(shí)可能誘發(fā)腦部受損、頭痛、嘔吐、疲勞、食欲不振、舌炎、胃酸缺乏和皮炎等，尤其是在嬰幼兒發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)明顯。嬰幼兒配方乳粉作為嬰幼兒攝取營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，各國非常重視，故對維生素添加量的監(jiān)控十分重要[4-5]。

嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量測定的方法主要是微生物法和高效液相色譜法，而微生物法靈敏度高、受基質(zhì)干擾小，是國家標(biāo)準(zhǔn)及AOAC（美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)）方法測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的指定方法[6]。

微孔板法是利用微生物方法，在微孔板中定量檢測嬰幼兒配方乳粉中的泛酸含量的方法。相比于國標(biāo)微生物法，微孔板法具有操作簡便、降低成本、提高工作效率的優(yōu)點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)主要通過采用實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的微孔板式微生物法與國標(biāo)微生物法對質(zhì)控樣品和不同品牌的市售嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的測定的比較，來分析實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的微孔板式微生物法在測定嬰幼兒配方乳粉泛酸含量中的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

SQP精密天平（德國Sartorius公司）、KQ5200DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、PB-10pH計(jì)（德國賽多利斯公司）、T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、2266潔凈工作臺(tái)（上海拜艾斯）、MX-S渦旋振蕩器（美國Scilogex公司）、HPS-400生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、PHOMO酶標(biāo)儀（鄭州安圖生物股份有限公司）及微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 材料與試劑

SRM 1849a質(zhì)控樣品[美國NIST，含量范圍（6.82±0.19）mg/100 g]；不同品牌的5種市售嬰幼兒配方乳粉；Millex-GP一次性無菌濾器（美國Millipore公司）。

植物乳桿菌ATCC 8014（美國Microbiologics公司）；泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乳酸桿菌瓊脂（美國BD公司）；乳酸桿菌肉湯（美國BD公司）；泛酸測定培養(yǎng)基（北京路橋公司）；無水乙醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 國標(biāo)微生物法

采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法對質(zhì)控樣品與5種市售不同品牌嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量進(jìn)行測定。每個(gè)樣品進(jìn)行7次平行測定，計(jì)算平行測定結(jié)果及結(jié)果間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。在一個(gè)樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)中間液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果并計(jì)算回收率。

1.4 微孔板式微生物法

1.4.1 測試菌液的制備

按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中接種液的制備方法制備測試菌液，并將測試菌液的透光率在550 nm處調(diào)節(jié)至30%～35%，備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，見表1。以各標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)吸光度為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)濃度泛酸含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度表

1.4.3 培養(yǎng)、測定與計(jì)算

用8聯(lián)排微量移液器在微孔板的每個(gè)微孔中加入5 μL制備好的植物乳桿菌（ATCC 8014）測試菌液，再用8聯(lián)排微量移液器移取150 μL已制備泛酸測定培養(yǎng)基于微孔中，用微量移液器移取150 μL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液與適當(dāng)稀釋的樣品溶液于指定的微孔中，加液完畢后，用微孔板封口膜封好微孔板，置生化培養(yǎng)箱37 ℃黑暗環(huán)境中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后將微孔板充分振蕩混勻，揭開微孔板封口膜，用移液器槍頭去除微孔中表面氣泡，利用酶標(biāo)儀在550 nm波長下讀取各微孔的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、泛酸含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2016）[8]中第一法微生物法的計(jì)算方法計(jì)算樣品泛酸含量。

依據(jù)本方法，對5種不同品牌市售嬰幼兒配方乳粉和質(zhì)控樣品進(jìn)行泛酸含量測定，每個(gè)樣品進(jìn)行7次平行測定，并對一種樣品進(jìn)行加標(biāo)，測定并計(jì)算回收率，通過精密度實(shí)驗(yàn)及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)本方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)微生物法結(jié)果

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5種不同品牌的市售嬰幼兒配方乳粉及質(zhì)控樣品中泛酸含量的測定結(jié)果見表2，各樣品結(jié)果間無顯著差異，RSD為1.14%～2.34%，方法重現(xiàn)性較好，精密度較高，且定值質(zhì)控樣品的實(shí)測值在含量范圍（6.82±0.19）mg/100 g內(nèi)接近于定值，說明國標(biāo)微生物法準(zhǔn)確度較高。

2.1.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對市售嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行泛酸加標(biāo)，采用國標(biāo)微生物法對其泛酸含量進(jìn)行測定并計(jì)算回收率，測定結(jié)果如表3所示，加標(biāo)回收率為97.6%～100.3%，平均回收率為98.96%，RSD為1.10%，回收率接近100%，說明國標(biāo)法的系統(tǒng)誤差小，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

表2 國標(biāo)微生物法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 國標(biāo)微生物法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 微孔板式微生物法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微孔板式微生物法測定不同品牌的嬰幼兒配方乳粉和質(zhì)控樣品中泛酸含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，各樣品結(jié)果間無顯著差異，RSD為1.34%～2.45%，說明本方法具有良好的重現(xiàn)性，精密度較高，且定值質(zhì)控樣品的實(shí)測值在含量范圍內(nèi)接近于定值，說明微孔板式微生物法準(zhǔn)確度較高。

表4 微孔板式微生物法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微孔板式微生物法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，回收率為93.2%～106.3%，平均回收率為101.0%，RSD為4.32%，回收率接近100%說明方法的系統(tǒng)誤差小，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

表5 微孔板式微生物法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 方法結(jié)果比較

采用兩種方法測定不同品牌的嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的結(jié)果如表6所示，各樣品的泛酸含量結(jié)果的平均值接近，兩方法測定各樣品結(jié)果經(jīng)F檢驗(yàn)，P＞0.05。采用雙樣本等方差t檢驗(yàn)對兩方法各樣品結(jié)果進(jìn)行分析P＞0.05，應(yīng)用兩種方法在測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量上無顯著差異，說明兩種方法相近，微孔板式微生物法可以替代國標(biāo)微生物法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量。

表6 方法結(jié)果比較表

3 結(jié)論

通過國標(biāo)微生物法與微孔板式微生物法對5種市售不同品牌的嬰幼兒配方乳粉及質(zhì)控樣品中泛酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明兩種方法的準(zhǔn)確度較高；且兩種方法測定的每種樣品的7個(gè)平行結(jié)果間的RSD值為1.14%～2.34%與1.34%～2.45%，方法重復(fù)性較好，精密度較高，且平行結(jié)果間均無顯著差異；兩種方法的平均回收率分別為98.96%與101.0%，都接近于100%，說明方法的系統(tǒng)誤差較小。且兩種方法測定各樣品泛酸含量的結(jié)果較接近，經(jīng)F檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)分析，兩方法在測定嬰幼兒配方乳粉中無顯著差異。結(jié)果表明采用的微孔板式微生物法在測定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量上與國標(biāo)微生物法具有相同的效果，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法重現(xiàn)性好、系統(tǒng)誤差小，能夠應(yīng)用于日常嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的測定中，減少工作量，提高工作效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。