高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中的 5種生物堿含量

◎ 賈琳斐，管 理，賈潤芳，張 鑫，尹 靜

（咸陽市食品藥品檢驗檢測中心，陜西 咸陽 712000）

罌粟殼為植物罌粟干燥后的成熟果殼，含有罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因等多種生物堿類物質(zhì)[1]。罌粟殼的主要成分在臨床具有一定的藥用價值，但長期食用含有罌粟殼的食品，會產(chǎn)生一定的依賴性，嚴(yán)重時甚至?xí)粑ソ叨劳鯷2]。國家發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中含有罌粟殼。因此，建立一種前處理快速、準(zhǔn)確性高的檢測方法，對食品中生物堿的測定具有重要的意義。

目前，測定食品中生物堿的方法有分光光度法[3]、高效液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7]及液相色譜-質(zhì)譜法[8-10]。其中，氣相色譜法和液相色譜法不能準(zhǔn)確定性目標(biāo)物，易造成假陽性結(jié)果，氣相色譜-質(zhì)譜法樣品前處理復(fù)雜，檢測成品較高，不適用于批量樣品檢測。

本實驗采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法通過優(yōu)化色譜條件，建立罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因5種生物堿快速、簡單、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈：美國Thermo公司生產(chǎn)；超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備。罌粟堿、那可丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.9%，美國CATO公司生產(chǎn)；可待因標(biāo)準(zhǔn)品：純度96.9%，中國食品藥品檢定研究院生產(chǎn)；蒂巴因、嗎啡、嗎啡-D3、可待因-D3標(biāo)準(zhǔn)品（液體）：純度99%，規(guī)格1 mg·mL-1，Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

PE Qsight 210液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（珀金埃爾默公司）；H1850離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、VXRBS025自動渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm），柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.3 mL·min-1；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為5 mmol·L-1乙酸銨；梯度洗脫程序：0～0.3 min，A、B比 例 為 10∶ 90；0.3～ 1.0 min，A、B由10∶ 90改 變 為 25∶ 75；1.0～ 3.5 min，A、B保持25∶75；3.5～4 min，A、B由25∶75改變?yōu)?0∶90；4～7 min保持10∶90。

1.3.2 質(zhì)譜條件

多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM），ESI+，干燥器流速：110 μL·min-1；脫溶劑氣溫度：320 ℃；霧化器流速：180 μL·min-1；離子源噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：400 ℃。各化合物質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取罌粟堿、可待因、那可丁標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.5%甲酸甲醇配制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用基質(zhì)空白溶液配制罌粟堿、那可丁、蒂巴因的標(biāo)準(zhǔn)系列 工 作 液：0.05 ng·mL-1、0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1和 1.0 ng·mL-1；嗎啡、可待因標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1和 25 ng·mL-1。內(nèi)標(biāo)濃度為 20 ng·mL-1。

1.3.4 樣品前處理

稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加入60 μL的5 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)物，液體、半固體加入3 mL水，固體樣品加入5 mL的0.1 mol·L-1鹽酸溶液，渦旋振蕩30 s，準(zhǔn)確加入15 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲處理30 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉的混合粉末，迅速振搖，渦旋振蕩1 min，以4 000 r·min-1離心5 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾。進(jìn)樣測定嗎啡、可待因；將濾液用乙腈稀釋20倍，進(jìn)樣測定罌粟堿、那可丁、蒂巴因。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

分別選用Phenomenex Kinetex HILIC柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） 和 Phenomenex Kinetex C18柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）2種不同的高效液相色譜柱對各組分進(jìn)行分離。結(jié)果表明，HILIC柱分離效果不佳，且峰型較差；而C18柱分離度較好，且峰型較HILIC柱更佳，故選擇Phenomenex Kinetex C18柱作為高效液相色譜柱。

2.1.2 流動相的選擇

分別配制0.1%甲酸水-甲醇，0.1%甲酸乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨作為流動相。結(jié)果顯示，選用0.1%甲酸水-甲醇作為流動相，5種組分峰型較寬，且分離度較差，罌粟堿與那可丁并未分開；選用0.1%甲酸乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨作為流動相，峰型較前兩者有明顯改善，分離效果佳，線性較好，且響應(yīng)最高，故選擇0.1%甲酸乙腈-5 mmol·L-1乙酸銨作為流動相。

2.2 方法檢出限及定量限

取5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的系列工作液進(jìn)樣，以罌粟堿、那可丁、蒂巴因的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，外標(biāo)法定量；以嗎啡、可待因的色譜峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰的比值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。S/N=3時對應(yīng)目標(biāo)物的含量為方法檢出限；S/N=10時對應(yīng)目標(biāo)物的含量為方法定量限。結(jié)果得出，罌粟堿、那可丁、蒂巴因的方法檢出限為2.5 μg·kg-1，方法定量限為 7.5 μg·kg-1。嗎啡、可待因方法檢出限為 12 μg·kg-1，方法定量限為 36 μg·kg-1。

2.3 精密度及回收率

準(zhǔn)確稱取16份陰性試樣各2 g于50 mL離心管中，一組作為空白對照，其余15份平均分為3組，進(jìn)行3梯度加標(biāo)試驗?；|(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量測定，計算方法回收率和精密度，結(jié)果見表2。由表中數(shù)據(jù)分析得知，該方法精密度、回收率均滿足痕量實驗分析要求。

表2 添加3種不同濃度的回收率及精密度表

3 結(jié)論

本研究使用三重四極桿電噴霧離子源（ESI），采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），可以準(zhǔn)確測定食品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因5種生物堿，其中，罌粟堿、那可丁、蒂巴因的檢出限為2.5 μg·kg-1，定量限為 7.5 μg·kg-1；嗎啡、可待因的檢出限為 12 μg·kg-1，定量限為 36 μg·kg-1。平均回收率為84.2%～96.0%，精密度為3.2%～6.8%。該方法準(zhǔn)確性好，前處理易操作，可用于生物堿的批量檢測。