蒙頂黃芽水溶性成分LC-TOF/MS指紋圖譜及定量分析

劉 曉,張 廳,唐曉波,馬偉偉,王小萍,李春華,王 云

(四川省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所,四川成都 610066)

黃茶是我國六大茶類之一,是一類小眾茶,為我國所獨有。按鮮葉原料老嫩可分為黃芽茶、黃小茶和黃大茶三類。其中蒙頂黃芽是黃芽茶中的精品,自古以來都是宮廷貢茶,產(chǎn)于四川省雅安市名山區(qū)蒙頂山茶區(qū)。黃芽具有干茶黃、湯色黃、葉底黃的特點,并有抗氧化[1]、助消化[2]、抑制肝損傷[3-4]等多種保健功能。蒙頂黃芽有著獨特的悶黃工藝及口感[5],受到越來越多消費者的青睞,產(chǎn)銷量持續(xù)增長,黃茶產(chǎn)業(yè)日漸壯大。蒙頂黃芽的相關(guān)研究也越來越引人關(guān)注。目前,蒙頂黃芽的研究主要集中在加工工藝[6-10]、品質(zhì)化學成分[11-16]、微生物動態(tài)變化規(guī)律[17-18]、生物學功能[19-20]等,但對黃茶水溶性成分的定量分析和采用水溶性成分進行黃茶的鑒別研究較少。而且,對黃茶鑒別和品質(zhì)評判多依賴于感官評價,缺少能夠量化的指標。

表1 供試蒙頂黃芽樣品的來源信息Table 1 Sources of Mengding yellow bud samples used in this study

本研究搜集四川24個典型蒙頂黃芽樣品,采用LC-TOF/MS指紋圖譜及定量分析蒙頂黃芽水溶性成分,研究蒙頂黃芽的典型加工工藝特征,并進一步利用聚類分析對蒙頂黃芽樣品進行分類,有助于構(gòu)建系統(tǒng)科學的標準化蒙頂黃芽品質(zhì)評價體系,為蒙頂黃芽的鑒別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

24個(S1～S24)蒙頂黃芽樣品 源自四川省的24個不同生產(chǎn)廠家,所有茶葉樣品的生產(chǎn)年份均為2019年3月,詳見表1,這24個茶樣有沒經(jīng)過悶黃的,有用陳茶炒黃的,有傳統(tǒng)工藝悶黃的,還有采用現(xiàn)代工藝悶黃的;考馬斯亮藍 G-250、95%乙醇、磷酸、濃硫酸、無水葡萄糖、無水碳酸鈉、無水磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、乙二胺四乙酸二鈉、抗壞血酸 成都科龍化工試劑廠;牛血清白蛋白、蒽酮、福林酚 分析純,美國Sigma-Aldrich公司;乙腈、甲酸、甲醇 色譜純,美國Sigma-Aldrich公司;乙酸 成都科龍化工試劑廠;標準品:沒食子酸(純度≥98%)、表兒茶素(純度≥98%)、表沒食子兒茶素(純度≥98%)、表兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%)、兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度≥98%) 美國Sigma-Aldrich公司;兒茶素(純度≥98.67)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(純度≥99.61%)、沒食子兒茶素(純度≥99.5%) 國家標準物質(zhì)中心;L-谷氨酸(純度≥99%) 日本TCI公司;咖啡堿(純度≥98%) 中國食品藥品檢定研究院。

1260型液相色譜儀 美國Agilent公司;1200/6210 型液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;JA2003型電子天平(精度:0.00001 g) 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市金壇友聯(lián)儀器研究所;UV-1700型紫外可見分光光度計 日本島津公司;5810R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;BP 211D型電子天平 德國Sartorius公司;Milli-Q型超純水器 美國Millipore公司;KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;XW-80A型漩渦混合器 上海馳唐實業(yè)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官審評方式 感官審評根據(jù)茶葉感官審評方法[21]黃茶標準進行。由5名國家二級評茶員以上資質(zhì)的茶葉審評專家組成審評小組,審評得分為5人評分的平均值,審評術(shù)語由主評綜合5人結(jié)果給出最后評語。其中外形占25%,湯色占10%,香氣占25%,滋味占30%,葉底占10%。

1.2.2 可溶性蛋白質(zhì)的測定 參考劉小華等的方法,采用考馬斯亮藍G-250比色法[22]法進行測定。

1.2.3 可溶性糖的測定 參照張正竹[23]主編《茶葉生物化學實驗教程》中“實驗2-6”進行測定。

1.2.4 茶多酚含量測定 參照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[24]進行測定。

1.2.5 游離氨基酸酸總量測定 參照GB/T 8314-2013《茶 游離氨基酸總量的測定》[25]進行測定。

1.2.6 兒茶素組分和咖啡堿含量的測定 參照GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[24]的前處理方法進行制備供試液,并按照如下液相色譜條件進行測定:

液相色譜柱:Gemini? 5 μm C18 110 A,250 mm×4.6 mm;流動相A為0.1%乙酸水溶液,流動相B為乙腈,檢測波長278 nm,柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,進樣量10 μL。梯度洗脫方法見表2:

表2 流動相的梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.2.7 指紋圖譜的測定 準確稱取0.2 g粉碎茶樣于50 mL具塞離心管中,加入20 mL 90 ℃的蒸餾水,立即放入90 ℃水浴中浸提20 min,每隔5 min渦旋振蕩10 s。提取完成后,靜置,冷卻至室溫,取1 mL上層清液于12000 r/min下離心8 min,供LC-TOF MS測定。

LC-TOF/MS測定色譜條件:

液相色譜柱:Agilent XDB-C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:A為0.1%甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.2 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。

LC-TOF/MS測定質(zhì)譜條件:

離子源:電噴霧離子源,正離子模式;霧化器壓力:40 psi;毛細管電壓:3500 V;干燥氣流量:10 L/min;干燥氣溫度:350 ℃;除液電壓:65 V;錐孔電壓:120 V;掃描方式:全掃描。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行實驗數(shù)據(jù)處理與標準曲線繪制,然后采用DPS 9.50軟件進行因子分析和聚類分析。對所有蒙頂黃芽樣品進行LC-TOF MS分析后,將色譜圖數(shù)據(jù)文件導入《國家藥典》委員會發(fā)布的中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.1版),生成四川蒙頂黃芽的LC-TOF/MS共有峰特征指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以標準物質(zhì)量濃度(mg/mL)為x軸,峰面積為y軸,繪制標準曲線,得到9種水溶性成分對照品溶液的線性回歸方程,如表3所示。每種對照品的峰面積與質(zhì)量濃度間的相關(guān)系數(shù)均大于0.999,說明線性關(guān)系良好。

表3 蒙頂黃芽中多種成分色譜蜂面積 與質(zhì)量濃度間的線性回歸方程Table 3 Linear equation between peak areas and concentrations of Mengding yellow bud components

2.2 四川蒙頂黃芽感官品質(zhì)研究

四川蒙頂黃芽樣品的感官審評結(jié)果見表4。由表中可知,24個蒙頂黃芽的感官品質(zhì)有非常明顯的差異,在干茶外形方面,蒙頂黃芽的形狀、勻整度等方面差異不大;但在干茶外觀顏色方面,1和4號以翠綠為主,8、17和21號以黃為主,其他樣品色澤以嫩黃為主。在內(nèi)質(zhì)湯色方面,12號嫩黃鮮亮,1、4、14、15、19號和20號的湯色以黃綠為主,2、3、5、6、7、8、11、17號和21號的湯色以黃為主,23號和24號的湯色以淡黃為主,9、10、13、16、18號和22號以綠黃為主。在內(nèi)質(zhì)滋味方面,3、6、10、12號和13號以鮮醇為主,2、5、7、8、17、18、19、21號 和22號以醇和為主,9、11、14、15、16、20號和24號以醇厚為主,1號和4以濃厚為主。在內(nèi)質(zhì)香氣方面,1號和4號以栗香為主,2、5、6、7、12、13、15、16、18、19、20、23號和24號以甜香為主,3、9、10、11、14號和22號以清鮮為主,8、17和21號帶火功香。在葉底方面,2、12、14、15、16號和18號以嫩黃為主,3、5、6、7、8、9、10、11、13、19、20、22、23號和24號以黃為主,1號和4號嫩綠較亮,8、17號和21號黃欠亮。綜合上述,1號和4號偏綠茶品質(zhì)特征,8、17和21號偏陳茶品質(zhì)特征,其他樣品呈現(xiàn)黃茶品質(zhì)特征。24個樣品感官審評結(jié)果差異很大,主要是由悶黃工序的有無及悶黃條件的不同引起。

表4 不同蒙頂黃芽感官審評結(jié)果Table 4 Sensory evaluation results of different Mengding yellow bud

2.3 四川蒙頂黃芽指紋圖譜的構(gòu)建

按照已建立的LC-TOF/MS分析方法,對24個不同廠家的24個蒙頂黃芽樣品進行分析,將所得到的色譜圖數(shù)據(jù)文件導入《國家藥典》(2012.1版)發(fā)布的中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng),得到蒙頂黃芽的LC-TOF/MS指紋圖譜,如圖1所示。選擇出峰時間適中、峰面積在色譜圖中所占比例較大,且在四川蒙頂黃芽樣品中均穩(wěn)定存在的3號峰作為參照峰,共發(fā)現(xiàn)16個共有峰,如圖2所示,通過與對照品液相譜圖比對,共確定了9種化合物,分別為GC(沒食子兒茶素)、EGC(表沒食子兒茶素)、CAF(咖啡堿)、C(兒茶素)、EC(表兒茶素)、EGCG(表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、GCG(沒食子兒茶素沒食子酸酯)、ECG(表兒茶素沒食子酸酯)與CG(兒茶素沒食子酸酯)。

圖1 24個蒙頂黃芽樣品的LC-TOF/MS指紋圖譜Fig.1 LC-TOF/MS fingerprints of 24 Mengding yellow bud samples

2.4 四川蒙頂黃芽水溶性成分的含量分析

按照1.2.6節(jié)中的方法進樣10 μL,連續(xù)進樣3次,計算峰面積平均值,根據(jù)相應化合物標準曲線方程,計算各茶葉中8種主要成分的含量,以干質(zhì)量計,如表5所示。1號、4號的GC、EGC含量較低,EGCG和ECG含量較高,GC和EGC屬于非酯性兒茶素,收斂性較弱,味醇和不苦澀;EGCG和ECG酯型兒茶素具有強烈收斂性,苦澀味較重,因此1號和4號呈現(xiàn)出綠茶的滋味特征;8號、17號和21號的EGCG均較低,8號最低,可能是因為在陳放過程中EGCG發(fā)生氧化反應而減少,與感官審評結(jié)果一致。不同蒙頂黃芽主要水溶性成分含量與周繼榮等[9]人的研究結(jié)果一致,究其原因是因為苦澀口感特征的EGCG、ECG在悶黃的過程中水解成醇和口感特征的GC、EGC等。

表5 不同蒙頂黃芽主要水溶性成分含量(mg/g)Table 5 Contents of major components in different brands of Mengding yellow bud(mg/g)

圖2 蒙頂黃芽水溶性成分共有峰LC-TOF/MS指紋圖譜Fig.2 The common peak LC-TOF/MS fingerprint of water-soluble components of Mengding yellow bud注:1:GC;2:EGC;3:CAF;4:EC;5:C; 6:GCG;7:EGCG;8:ECG;9:CG。

從表6可以看出,采用現(xiàn)代工藝悶黃12號的茶多酚含量最低,酚氨比低,可溶性糖和氨基酸含量較高,與感官審評結(jié)果一致;1號和4號沒經(jīng)過悶黃,茶多酚和咖啡堿含量高,滋味濃厚;8號、17號和21號茶多酚含量均較低,是因為在貯藏過程中多酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應形成兒茶素類；8號可溶性糖含量較高,可能是在炒黃過程中多糖類物質(zhì)受高溫作用發(fā)生脫水反應分解成可溶性糖；11、15、18、17號游離氨基酸總量最低,這可能是氨基酸在貯藏的過程中氧化降解所致[26]。綜上所述,不同蒙頂黃芽主要生化成分分析結(jié)果與感官審評結(jié)果一致。

2.5 四川蒙頂黃芽樣品的因子分析和聚類分析

表6 不同蒙頂黃芽主要生化成分分析結(jié)果Table 6 Contents of main biochemistry components in different brands of Mengding yellow bud

對蒙頂黃芽樣品的品質(zhì)成分進行因子分析,所得的因子特征值和貢獻率如表7所示。根據(jù)特征值大于1的原則提取了4個因子,其方差貢獻率分別為33.42%、21.23%、16.97%、8.82%,其所包含的信息量占總體信息量的80.44%,基本反映了大部分變量的信息。

表7 因子分析特征值和貢獻率Table 7 Eigenvalue and contribution rate of factor analysis

通過對因子的載荷矩陣旋轉(zhuǎn)之后,可使載荷系數(shù)更接近1,這樣得到的公因子能夠更好的解釋和命名變量[27-28]。對載荷矩陣進行方差極大正交旋轉(zhuǎn),得到因子載荷矩陣方差為0.4568,因子載荷矩陣如表8所示。由表8可知,公因子1累積貢獻率為28.93%,對應特征向量中貢獻最大的是GC、EGC、EC和咖啡堿,其特征向量值均值0.80以上,基本可以代表非酯型兒茶素類和咖啡堿。公因子2累積貢獻率為42.48%,對應的特征向量為ECG、CG和可溶性糖,基本可以代表酯型兒茶素類、蛋白質(zhì)和糖類。公因子3累積貢獻率為61.68%,對應的特征向量中貢獻最大的C、EGCG和茶多酚,基本可以代表茶多酚。公因子4累積貢獻率為75.58%,對應的特征向量為游離氨基酸和酚氨比,基本可代表氨基酸。

表8 因子載荷矩陣Table 8 Rotated component matrix

根據(jù)因子分析的結(jié)果,對4個公因子(表8)的品質(zhì)成分采用組間聯(lián)接的聚類方法和平方歐式距離區(qū)間測量法進行聚類分析如圖3。在遺傳距離小于20處(如圖3所示)進行聚類分析,可分為4個大的類群(圖3)。沒經(jīng)過悶黃的1、4號聚為一類;采用現(xiàn)代工藝悶黃的12號聚為一類;用陳茶炒黃的8、17號和21號聚為一類;傳統(tǒng)工藝悶黃的2、3、5、6、7、9、10、11、13、14、15、16、18、19、20、22、23號和24號聚為一類。不同黃茶樣品的聚類分析結(jié)果表明,不同加工工藝對黃茶內(nèi)含化學成分的影響較大,可利用聚類分析對我國不同加工工藝和不同產(chǎn)地的黃茶樣品進行初步區(qū)分。

圖3 不同蒙頂黃芽樣品的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果Fig.3 Results of systematic cluster analysis of different Mengding yellow bud samples

3 結(jié)論

目前,對蒙頂黃芽的LC-TOF/MS指紋圖譜研究尚未見報道。本試驗初步構(gòu)建了蒙頂黃芽的LC-TOF/MS指紋圖譜,結(jié)果顯示,24個四川蒙頂黃芽樣品均有16個共有峰,但峰面積存在差異,說明不同廠家的四川蒙頂黃芽樣品,由于生產(chǎn)工藝的差異,造成其內(nèi)含化學成分含量的不同;通過聚類分析能初步區(qū)分不同工藝的蒙頂黃芽樣品。悶黃是黃茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序,悶黃過程中的濕熱作用導致多酚類物質(zhì)的降低,但黃茶作為輕發(fā)酵茶,其品質(zhì)形成機理可能還有殘余酶類參與多酚類化合物的氧化,本身就存在內(nèi)在的不穩(wěn)定性,這也是黃茶指紋圖譜研究的難點,這就需要實施茶葉的規(guī)范化加工,搜集更多全國范圍的黃茶,并運用聯(lián)用技術(shù)獲得全國黃茶的特征譜及特征性成分,以更好地對黃茶物質(zhì)基礎(chǔ)進行研究。

本實驗利用LC-TOF/MS法構(gòu)建了24個蒙頂黃芽樣品的LC-TOF/MS指紋圖譜,得到了有關(guān)四川蒙頂黃芽質(zhì)量的綜合信息,并在此基礎(chǔ)上進行了定量分析,因子分析表明,14個品質(zhì)成分綜合為4個公因子,前4個公因子的特征值大于1且累計貢獻率達80.44%,主要代表性指標為兒茶素類、咖啡堿、蛋白質(zhì)和糖類等,并找到了不同工藝蒙頂黃芽水溶性成分的含量差異;當臨界值小于20時,通過聚類分析將24個樣品分為4類。LC-TOF/MS指紋圖譜結(jié)合定量分析分離效率高、分析速度快、準確率高,同時為蒙頂黃芽提供了量化的鑒定方法,比通過單一成分測定得到的結(jié)果更為豐富和全面,具有一定的優(yōu)越性,不僅可應用于黃茶質(zhì)量評價、黃茶加工工藝全過程的質(zhì)量控制和最終產(chǎn)品的質(zhì)量評價,還可以應用于功能性成分的定性和定量,同時可以確保黃茶產(chǎn)品質(zhì)量的一致性、安全性及可靠性。本研究結(jié)果在一定程度上為四川蒙頂黃芽品質(zhì)真?zhèn)蔚蔫b定及產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供了參考依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。