響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝

姚 芳,張 偉,徐海祥,王海藍(lán),管 澎

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院,江蘇泰州 225300)

銀杏果藥食兼用,營養(yǎng)豐富,除含淀粉(60%)、蛋白質(zhì)類(13%)、糖類(7%)、脂肪類(4%)外,還含有銀杏黃酮、銀杏酚、銀杏內(nèi)酯、銀杏酸等特有的活性成分[1],在抗氧化、益智健腦、提高免疫力、抗衰老、抗菌[2-5]等方面具有一定的療效,在功能食品領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

銀杏蛋白是銀杏果中重要的功能成分,據(jù)研究銀杏果的抗氧化性與其水溶性蛋白含量有著密切關(guān)系[6-7],利用微生物與銀杏果共發(fā)酵,提高活性成分含量是近年來研究的熱點。研究表明[8-11]微生物可利用和代謝銀杏中的成分,增加可溶蛋白、黃酮和內(nèi)酯的含量。植物乳桿菌和釀酒酵母是發(fā)酵食品中常用的微生物,二者之間存在共生與互補關(guān)系[12-13]。已有采用發(fā)酵技術(shù)改變銀杏葉中銀杏酸含量[10-11]、蛋白含量[14]、提高免疫活性[15]和抗氧化活性[9]等的研究,但有關(guān)銀杏果發(fā)酵技術(shù)的研究較少。

本研究以泰州大佛指銀杏果為原料,采用響應(yīng)面優(yōu)化銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝,以期得到一種高抗氧化活性的銀杏發(fā)酵粉,為銀杏果的精深加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏果 大佛指,江蘇中藥科技園;中溫α淀粉酶 4000 U/g、糖化酶 100 U/mg、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;植物乳桿菌 Dy-1,江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院實驗室提供;釀酒酵母 凍干粉,江南大學(xué)生物發(fā)酵與分離研究室提供;DPPH 純度≥98%,sigma公司;牛血清白蛋白 分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司;Tris 分析純,美國amresco;MRS肉湯培養(yǎng)基 優(yōu)級純,北京陸橋技術(shù)股份有限公司;銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99%,北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)G250、鹽酸、甲醇、正己烷、乙腈、ABTS等試劑 分析純,國藥集團。

T6-紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;高速萬能粉碎機 天津市華鑫儀器廠;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;Labconco FreeZone 6 L臺式冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;Thermo 702超低溫冰箱 美國賽默飛世爾科技公司;DHG-9101-2S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;JM-L80實驗室膠體磨 溫州昊星機械設(shè)備制造有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺 吳江市亞泰凈化設(shè)備有限公司;MaxQ 4000恒溫培養(yǎng)搖床 賽默飛世爾科技公司;RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;回流提取裝置 上海申玻儀器公司;SPX-250S·Ⅱ生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;PRIMOR型高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多集團;安捷倫1260高效液相色譜儀(配紫外檢測器) 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏果的加工工藝

1.2.1.1 干燥粉碎(G) 鮮銀杏果預(yù)煮1 h后去殼、去芯,搗碎,60 ℃干燥4 h,80 ℃干燥1 h、100 ℃干燥1 h、120 ℃干燥0.5 h,粉碎制成小于200目的銀杏粉(G)。

1.2.1.2 單酶解(M) 在干燥粉碎樣的基礎(chǔ)上,取100 g樣加質(zhì)量比為1∶6的水,用膠體磨研磨3 min。置于沸水浴中加熱攪拌20 min,取出冷卻至60 ℃。添加銀杏果重量0.3 g/100 g的糖化酶和α淀粉酶復(fù)合酶制劑,在60 ℃下攪拌酶解2 h,100 ℃下滅酶15 min,取出冷卻至35 ℃,冷凍干燥。

1.2.1.3 單乳酸菌發(fā)酵(R) 在干燥粉碎樣的基礎(chǔ)上,取100 g樣加質(zhì)量比為1∶6的水,用膠體磨研磨3 min。置于沸水浴中加熱攪拌20 min,取出冷卻至35 ℃。加入3 g/100 g植物乳桿菌,32 ℃的恒溫?fù)u床發(fā)酵12 h,取出將全部料液倒入多個平皿中,先在-78 ℃冰箱中預(yù)凍2 h,然后放到凍干機中冷凍干燥。

1.2.1.4 乳酸菌+酵母菌聯(lián)合發(fā)酵(R+J) 在干燥粉碎樣的基礎(chǔ)上,取100 g樣加質(zhì)量比為1∶6的水,用膠體磨研磨3 min。置于沸水浴中加熱攪拌20 min,取出冷卻至35 ℃。分別加入1.5 g/100 g植物乳桿菌和釀酒酵母,32 ℃的恒溫?fù)u床發(fā)酵12 h,冷凍干燥。

1.2.1.5 酶解+乳酸菌聯(lián)合處理(M+R) 在單酶解的基礎(chǔ)上,加入3 g/100 g植物乳桿菌,32 ℃的恒溫?fù)u床發(fā)酵12 h,冷凍干燥。

1.2.1.6 酶解+乳酸菌+酵母菌聯(lián)合處理(M+R+J) 即為菌酶協(xié)同發(fā)酵工藝,在單酶解的基礎(chǔ)上,分別加入1.5 g/100 g植物乳桿菌和釀酒酵母,32 ℃的恒溫?fù)u床發(fā)酵12 h,冷凍干燥,從而獲得銀杏果發(fā)酵粉(GFP)。

1.2.2 單因素實驗 設(shè)定1∶6 g/mL的料液比,復(fù)合酶制劑添加總量0.3 g/100 g,糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比2∶1,酶解時間2 h,混合發(fā)酵劑添加總量3 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比1∶1,發(fā)酵時間12 h,為固定水平。以可溶性蛋白含量和DPPH自由基清除率為指標(biāo),分別考察料液比(1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9 g/mL)、復(fù)合酶制劑添加總量(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/100 g)、糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、酶解時間(1、1.5、2、2.5、3 h)、混合發(fā)酵劑添加總量(1.5、2.25、3、3.75、4.5 g/100 g)、植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、發(fā)酵時間(6、12、18、24、30 h)對銀杏果發(fā)酵粉可溶性蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface method

1.2.3 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以銀杏果發(fā)酵液對DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,選取料液比、糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比、混合發(fā)酵劑添加總量、植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比4個因素設(shè)計四因素三水平試驗,進而優(yōu)化銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵的最適條件,因素水平見表1。

1.2.4 銀杏果發(fā)酵粉可溶性蛋白質(zhì)的測定 采用考馬斯亮藍(lán)法[16]測定:取0.2 g銀杏果發(fā)酵粉,加入25 mL的0.15 mol/L Tris-HCL緩沖液(pH8.5),磁力攪拌提取0.5 h,后于4 ℃、7000 r/min離心15 min,取適量上清液和5 mL考馬斯亮藍(lán)染液,混勻,室溫靜置5 min后在595 nm處測定其吸光度。以牛血清白蛋白為標(biāo)樣,制得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=0.006x+0.0194(R2=0.995)。

1.2.5 銀杏果發(fā)酵粉抗氧化活性的測定 以DPPH自由基清除能力作為衡量銀杏果發(fā)酵粉抗氧化能力的指標(biāo),參照王希[17]的方法進行測定。將2 mL銀杏果發(fā)酵液和2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻,暗處靜置30 min,于517 nm處測得樣品的吸光度A1;用2 mL甲醇代替DPPH測得本底吸光度A2;用2 mL甲醇加2 mL DPPH溶液測得空白對照吸光度A0,試驗設(shè)置2個重復(fù)。清除率S(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

1.2.6 銀杏果銀杏酸含量的測定

1.2.6.1 樣品預(yù)處理 稱取銀杏果發(fā)酵粉10 g溶于200 mL無水甲醇,70 ℃水浴回流3 h,搖勻后過濾,將濾液濃縮,用正己烷萃取3次,每次20 mL,合并萃取液于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,用甲醇定容至10 mL,0.45 μm濾膜過濾,得樣品分析液。

1.2.6.2 HPLC法色譜條件 參照王蕎薇等[18]的方法采用HPLC法測定銀杏酸含量,用無水甲醇配制0.5 mg/mL的銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。色譜柱:安捷倫XDB-C18毛細(xì)管柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1%磷酸水溶液(94+6);時間40 min;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長310 nm;進樣量20 μL。

1.2.7 銀杏果發(fā)酵粉主要成分含量的測定

1.2.7.1 粗蛋白的測定 凱氏定氮法,參照GB 5009.5-2016。

1.2.7.2 脂肪的測定 索氏抽提法,參照GB 5009.6-2016。

1.2.7.3 淀粉的測定 酸水解法,參照GB 5009.9-2016。

1.2.7.4 還原糖的測定 直接滴定法,參照GB 5009.7-2016。

1.2.7.5 總酸的測定 酸堿滴定法,參照GB/T 12456-2008。

1.2.7.6 黃酮的測定 將樣品用料液比1∶10的70%乙醇70 ℃回流提取2 h,離心取上清液,低溫濃縮,用硝酸鋁比色法[19]測定。以蘆丁為標(biāo)樣,制得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=10.677x-0.0034(R2=0.9996)。

1.2.7.7 多酚的測定 將樣品用料液比1∶50的60%乙醇60 ℃回流浸提2 h,離心取上清液,低溫濃縮,用福林酚法[20]測定。以沒食子酸為標(biāo)樣,制得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=9.7809x+0.0135(R2=0.9995)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次,采用Design-Expert 8.05b軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進行分析,利用F檢驗進行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 銀杏果不同加工方式的選擇 采用單酶解(M)、單乳酸菌(R)、乳酸菌+酵母菌(R+J)、酶解+乳酸菌(M+R)、酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)5種不同加工方式,研究其對銀杏果樣品可溶性蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響,以銀杏粉樣(G)為對比,確定銀杏果的最適加工方式,見圖1。

圖1 不同加工方式對銀杏果樣品可溶性蛋白含量 和DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effects of different processing methods on soluble protein content and DPPH radical scavenging capacity of ginkgo seeds注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

由圖1可知,與未經(jīng)加工處理的銀杏粉樣(G)相比,采用5種不同加工方式處理后的銀杏果樣品,其可溶性蛋白含量均增加,對DPPH自由基的清除率均增加,但增加的程度不一致,其中采用酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)處理后的銀杏果樣品,其可溶性蛋白含量最高,對DPPH自由基的清除率最大,且與其他加工方式處理后的銀杏果樣品相比有顯著差異。說明先采用復(fù)合酶制劑(糖化酶和淀粉酶)酶解后,再通過發(fā)酵劑(植物乳桿菌和釀酒酵母)進行發(fā)酵的方式處理銀杏果,制備的發(fā)酵銀杏粉中可溶性蛋白含量最多,抗氧化活性最強,與未處理的銀杏粉(G)相比,可溶性蛋白含量增加了400.1%,DPPH自由基清除率增加了203.6%。馬琦媛[21]亦發(fā)現(xiàn)采用乳酸桿菌和釀酒酵母發(fā)酵小米,有效改善了小米中植酸含量、氨基酸組成。因此后續(xù)試驗采用酶解+乳酸菌+酵母菌(M+R+J)即菌酶協(xié)同發(fā)酵法處理銀杏果樣品。

2.1.2 料液比對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同料液比對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖2。隨料液比增加,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率均呈先增大后緩慢減小的趨勢,料液比為1∶6 g/mL時,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白的含量最多,DPPH自由基清除率最大,且與其他處理樣品相比有顯著差異。這可能是因為生化反應(yīng)時含水量少不利于銀杏果的充分發(fā)酵,含水量太多會導(dǎo)致銀杏發(fā)酵粉中的可溶性蛋白等抗氧化物質(zhì)的相對含量減少,從而減弱了抗氧化效果。故較佳的料液比為1∶6 g/mL。

圖2 料液比對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on GFP

2.1.3 復(fù)合酶制劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同復(fù)合酶制劑添加量對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖3。隨復(fù)合酶制劑添加量的增加,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率均呈先增大后緩慢減小的趨勢,復(fù)合酶制劑添加總量為0.3 g/100 g時,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白的含量最多,DPPH自由基清除率最大,且與其他處理樣品相比有顯著差異。這可能是因為復(fù)合酶制劑添加總量低時,酶解出的可溶性糖類物質(zhì)較少,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較緩慢,水解出的可溶性蛋白、黃酮、多酚[22]等抗氧化物質(zhì)較少,抗氧化活性較低。添加總量高時,酶解出的可溶性糖類物質(zhì)較多,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較快,消耗的蛋白增多,可溶性蛋白含量減少,雖然銀杏黃酮、多酚含量增加,但總抗氧化活性緩慢下降。故較佳的復(fù)合酶制劑添加量為0.3 g/100 g。

圖3 復(fù)合酶制劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.3 Effects of total amount of compound enzyme on GFP

2.1.4 糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖4。糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率影響較大,酶添加量和酶解時間一定時,糖化酶比例低,酶解出的可溶性糖類物質(zhì)較少,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較緩慢,水解出的可溶性蛋白、多酚等抗氧化物質(zhì)較少,抗氧化活性較低。糖化酶比例高,酶解出的可溶性糖類物質(zhì)較多,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較快,消耗的蛋白增多,可溶性蛋白含量減少,雖然多酚含量增加,但總抗氧化活性下降。故較佳的糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比為2∶1。

圖4 糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.4 Effects of mass ratio of glucoamylase and α-amylase on GFP

2.1.5 酶解時間對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同酶解時間對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖5。隨著酶解的延長,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量先增加后基本不變,酶解3 h后減少,可能是因為酶解時間長,得到的可溶性糖類多,植物乳桿菌和釀酒酵母的生長較快,可溶性蛋白含量減少。隨著酶解的延長,銀杏發(fā)酵粉對DPPH自由基的清除率先增加,2 h后基本保持不變,可能是因為糖化酶和α淀粉酶能打斷糖苷鍵,增加多酚類物質(zhì)的釋放[23],但可溶性蛋白含量減少,故抗氧化活性基本不變。較佳的酶解時間為2 h。

圖5 酶解時間對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.5 Effects of enzymolysis time on GFP

2.1.6 混合發(fā)酵劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同混合發(fā)酵劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖6。

圖6 混合發(fā)酵劑添加總量對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.6 Effects of total amount of mixed fermentation agent on GFP

由圖6可知,隨混合發(fā)酵劑添加總量的增加,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率均呈先增大后減小的趨勢,混合發(fā)酵劑添加總量為3 g/100 g時,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白的含量最多,DPPH自由基清除率最大,且與其他處理樣品相比有顯著差異。發(fā)酵劑添加量的多少與活性成分的含量密切相關(guān),熊濤等[24]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌主要利用菌體分泌的酶水解基質(zhì)中的蛋白為多肽和氨基酸來提供氮源。酵母菌生長繁殖所需的能量主要來自糖類的分解代謝。發(fā)酵劑添加量在1.5～3.0 g/100 g時,發(fā)酵劑水解銀杏果中大分子蛋白為可溶性蛋白的量持續(xù)增加,銀杏果結(jié)合態(tài)多酚在植物乳桿菌的作用下被釋放出來或轉(zhuǎn)化成了新的多酚,銀杏果的抗氧化活性持續(xù)增加。當(dāng)發(fā)酵劑添加量超過3.0 g/100 g時,銀杏果中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量發(fā)酵劑的生長,消耗的蛋白增多,同時也消耗酚類物質(zhì)[25],抗氧化活性下降。故較佳的發(fā)酵劑添加量為3.0 g/100 g。

2.1.7 植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖7。植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響較大,植物乳桿菌在生長時,會分泌淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等水解酶和有機酸[26],這些酶將淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì),同時酸性環(huán)境激活了銀杏果中各種內(nèi)源酶。釀酒酵母含豐富的蛋白質(zhì)和酶,主要分解代謝糖類,在酸性環(huán)境中生長較慢。發(fā)酵劑添加量和發(fā)酵時間一定時,植物乳桿菌比例低,水解出的可溶性蛋白、多酚等抗氧化物質(zhì)較少,抗氧化活性較低。植物乳桿菌比例高,自身代謝所需要的蛋白增多,可溶性蛋白含量減少,抗氧化活性下降。故較佳的植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比為1∶1。

圖7 植物乳桿菌和釀酒酵母 添加質(zhì)量比對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.7 Effects of mass ratio of lactobacillus plantarum and saccharomyces cerevisiae on GFP

2.1.8 發(fā)酵時間對銀杏發(fā)酵粉可溶蛋白含量和DPPH自由基清除率的影響 研究不同發(fā)酵時間對銀杏發(fā)酵粉的影響,見圖8。隨著發(fā)酵時間延長,銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白含量先增加后緩慢下降,可能是因為植物乳桿菌和釀酒酵母生長過程中能分泌很多胞外酶,發(fā)酵時間短,酶量不充足,生成的活性物質(zhì)少,可溶性蛋白含量低,抗氧化活性也低;而發(fā)酵時間太長,蛋白進一步水解為氨基酸或被代謝利用,可溶性蛋白含量減少。隨著發(fā)酵時間延長,DPPH自由基清除率先增加,12 h后基本保持不變,可能是酚酸類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后,由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài),多酚含量增加,但可溶性蛋白含量減少,故抗氧化活性基本不變。較佳的發(fā)酵時間為12 h。

圖8 發(fā)酵時間對銀杏發(fā)酵粉的影響Fig.8 Effects of fermentation time on GFP

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface method

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2 銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝的響應(yīng)面試驗分析

2.2.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面分析試驗根據(jù)Box-Behnken設(shè)計進行了29組試驗,結(jié)果見表2,回歸模型的方差分析見表3。

2.2.2 響應(yīng)面因素間的交互作用分析 料液比、糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比、混合發(fā)酵劑添加總量、植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比4個因素在銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵過程中的兩兩交互作用見圖9。

曲面圖的形狀是各因素影響DPPH自由基清除率大小最直觀的展示,曲面越陡峭,說明影響越顯著[27]。由圖9可看出c、e、f三圖中曲面較為陡峭,且等高線密度分布不均勻,呈橢圓形,說明植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比與混合發(fā)酵劑添加總量、糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比、料液比的交互作用較強,對DPPH自由基清除率的影響較顯著,各因素對銀杏發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響順序為植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比>混合發(fā)酵劑添加總量>糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比>料液比,與表3中方差分析結(jié)果一致。

2.3 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗所得的銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)結(jié)果和二次多項回歸方程,利用Design Expert 8.05b軟件中的“Optimization”模塊分析得出優(yōu)化結(jié)果,即獲得較好DPPH自由基清除效果的工藝參數(shù)為料液比1∶63 g/mL,糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比2.1∶1,混合發(fā)酵劑添加總量3.12 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比1.06∶1,銀杏發(fā)酵粉對DPPH自由基清除率預(yù)測可達(dá)到69.72%。考慮實際操作便利,將銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)修正為料液比1∶6,糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比2∶1,混合發(fā)酵劑添加總量3.12 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比1∶1,采用修正后的工藝參數(shù)進行3次平行驗證試驗,結(jié)果測得DPPH自由基清除率為69.7±1.1%,可見該模型能較好地預(yù)測具有抗氧化活性的銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝參數(shù)。由最佳工藝制得的銀杏發(fā)酵粉(GFP)與未處理的銀杏粉(G)相比,DPPH自由基清除率增加了257.4%。

2.4 銀杏發(fā)酵粉品質(zhì)的檢測

2.4.1 銀杏發(fā)酵粉銀杏酸含量的檢測 銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品、銀杏粉(G)、銀杏發(fā)酵粉(GFP)中銀杏酸的高效液相色譜圖分別如圖10所示。

由圖10可知,通過與圖10A各標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時間相對比,銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,銀杏酸的的含量發(fā)生了顯著的變化,其中銀杏新酸(C13∶0)的含量略微下降,銀杏酸(C15∶1)和十七烷一烯銀杏酸(C17∶1)含量顯著下降(P<0.05),十七烷二烯銀杏酸(C17∶2)含量幾乎下降為零。銀杏發(fā)酵粉中銀杏酸含量2.96 μg/g,低于2015版《中國藥典》規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)10 μg/g,與干燥粉碎的銀杏粉(G)相比,銀杏酸脫除率達(dá)85.4%,說明銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,對銀杏酸的脫毒效果非常顯著,達(dá)到了減毒的目的,提高了銀杏果的食用安全性?？赡苁且驗樵趦?yōu)勢植物乳桿菌和釀酒酵母菌的發(fā)酵作用下,銀杏酸發(fā)生了轉(zhuǎn)化,降低了含量[10,28]。

表4 銀杏發(fā)酵粉的主要活性成分Table 4 The main active components of ginkgo fermentation powder

圖10 各試樣HPLC圖譜Fig.10 HPLC chromatogram of different samples注:A. 銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品的的HPLC圖譜; B. 銀杏粉中銀杏酸的HPLC圖譜; C. 銀杏發(fā)酵粉中銀杏酸的HPLC圖譜。

2.4.2 銀杏發(fā)酵粉主要活性成分分析 銀杏發(fā)酵粉的主要活性成分含量見表4。

由表4可知,銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,與普通的銀杏粉相比,銀杏發(fā)酵粉的粗蛋白、脂肪、總酸、可溶性蛋白、還原糖、黃酮和多酚含量顯著增加(P<0.05),淀粉和銀杏酸含量顯著降低(P<0.05)。說明經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,銀杏果中大分子物質(zhì)生化轉(zhuǎn)化為可溶性小分子物質(zhì),同時消耗了糖,可溶性蛋白、黃酮、多酚等活性成分含量顯著增加,銀杏酸毒性成分含量顯著降低。

在發(fā)酵的過程中,糖化酶、淀粉酶將銀杏果中的淀粉酶解成葡萄糖等小分子糖類,為植物乳桿菌和釀酒酵母的生長代謝提供碳源,并減弱了其與蛋白的相互作用力,使得蛋白的溶解性增大[29]。植物乳桿菌將銀杏果蛋白水解成小分子的可溶性蛋白、多肽和氨基酸[30],同時發(fā)酵后基質(zhì)的pH下降,啟動了銀杏果內(nèi)源性蛋白酶,將大分子蛋白降解,提高了銀杏發(fā)酵粉中可溶性蛋白含量。黃酮類物質(zhì)是銀杏果中的主要活性成分,常與糖結(jié)合,以黃酮苷的形式存在[31]。糖化酶和淀粉酶可水解銀杏果中的淀粉,打斷糖苷鍵,釋放出黃酮物質(zhì),黃酮的含量增加。酚酸類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后,由結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化為游離態(tài),多酚含量增加。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上,以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,通過響應(yīng)面分析對銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,經(jīng)方差分析和響應(yīng)面圖得知,各因素對銀杏發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響順序為植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比>混合發(fā)酵劑添加總量>糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比>料液比。在復(fù)合酶制劑添加總量0.3 g/100 g,酶解2 h,發(fā)酵12 h的基礎(chǔ)上,確定銀杏果酶菌協(xié)同發(fā)酵最佳工藝為:料液比1∶6,糖化酶和α淀粉酶添加質(zhì)量比2∶1,混合發(fā)酵劑添加總量3.12 g/100 g,植物乳桿菌和釀酒酵母添加質(zhì)量比1∶1,測得DPPH自由基清除率為69.7±1.1%,與模型預(yù)測值基本一致。銀杏果經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后,與未處理的銀杏粉(G)相比,銀杏發(fā)酵粉(GFP)中DPPH自由基清除率增加了257.4%;可溶蛋白含量4.47±0.13 g/100 g,增加了330%;黃酮含量0.15±0.01 mg/g,增加了50%;多酚含量2.49±0.04 mg/g,增加了118%;銀杏酸含量2.96±0.32 μg/g,脫除率達(dá)85.4%。說明酶菌協(xié)同發(fā)酵能顯著提高銀杏果的抗氧化活性,制得的銀杏發(fā)酵粉中可溶蛋白、黃酮、多酚等抗氧化成分含量顯著增加、有毒成分銀杏酸含量顯著降低,為銀杏果的精深加工提供物質(zhì)基礎(chǔ),為銀杏果的高效利用開創(chuàng)了新的途徑。