不同聚合度原花青素分離制備的研究進(jìn)展

徐佳慧,陳明舜,陳 軍,張成浩,李 信,李 俶

(南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330000)

目前國(guó)內(nèi)外提取原花青素的方法主要有溶劑萃取[10]、超臨界流體萃取[11]、微波輔助萃取[12]、超聲波輔助萃取[13]以及酶解法[14]等。原花青素粗提物中含有很多雜質(zhì),需進(jìn)一步分離才能得到純度較高的產(chǎn)品。目前分離純化方法主要有溶劑萃取分離法、層析法[15]、吸附法[16]等。而一般來說,原花青素的分級(jí)方法可分為兩類:第一類是液-固色譜法,包括正相液相色譜、反相液相色譜、凝膠過濾色譜和親水相互作用色譜等;第二類是液-液色譜法,包括離心分離色譜、高速逆流色譜和漸進(jìn)溶劑沉淀法等[17]。另外,常用紫外分光光度法、香草醛檢測(cè)法、鉬酸銨分光光度法、鐵鹽催化比色法和高效液相色譜法等來測(cè)定原花青素含量[18]。通過分析產(chǎn)物的紫外吸收光譜、質(zhì)譜以及核磁共振譜鑒定并確認(rèn)其組成單元,再計(jì)算出原花青素的平均聚合度。

本文將從液-固色譜法和液-液色譜法這兩類方法的角度綜述常見的不同聚合度原花青素的制備方式,以期為更好地制備不同聚合度的原花青素提供理論依據(jù)和指導(dǎo),為進(jìn)一步研究原花青素聚合度與其生理活性的相關(guān)性創(chuàng)造可能性。

1 液-固色譜法制備原花青素

液-固色譜法是以固體吸附劑為固定相,液體為流動(dòng)相的常見分離方法,其分離原理是根據(jù)吸附于固定相中的各組分在液體流動(dòng)相中分配系數(shù)的不同,最終固液相對(duì)平衡而達(dá)到分離目的[19]。在正相色譜柱中,原花青素按其聚合度洗脫,硅膠珠常作為柱材。然而,在反相色譜柱中,原花青素按其極性洗脫,具有相同聚合度的原花青素同分異構(gòu)體之間可能具有不同的保留時(shí)間[20]。凝膠色譜法又稱分子排阻色譜法,常用的柱材有大孔吸附樹脂、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40等,由于其柱材相對(duì)易得、裝柱簡(jiǎn)單、使用方便、對(duì)高分子物質(zhì)分離效果好,因此目前應(yīng)用最為廣泛[21-22]。

1.1 高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)

研究表明,利用HPLC分級(jí)制備不同聚合度的原花青素,其原理是原花青素聚合度越高,活性酚羥基數(shù)量越少,分子極性越小,在非極性色譜柱上吸附得越緊密,流動(dòng)相較難洗脫,樣品出峰時(shí)間晚[23]。由于該方法進(jìn)樣量少,可以測(cè)定一定聚合度范圍內(nèi)原花青素含量,因此其在原花青素分級(jí)中多用于定性、定量分析。該方法的不足之處在于原花青素成分具有復(fù)雜性,同時(shí)受到對(duì)照品和分析手段的限制,目前還不能把其中的每一個(gè)成分單獨(dú)分離出來,只能得到一定聚合度范圍內(nèi)的原花青素,因此,在分級(jí)前應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,如利用硅膠柱層析、Sephadex LH-20、Sephadex G25、Toyopeah TSK HW40等柱層析方法或者薄層層析法,以免影響分級(jí)效果[24-25]。

1.2 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂法具有選擇性優(yōu)良、進(jìn)樣量大、重復(fù)使用方便及理化性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),在天然物質(zhì)分離純化中得到較多的研究和應(yīng)用。利用大孔吸附樹脂法分級(jí)原花青素的原理是原花青素的聚合度越高,單位質(zhì)量的原花青素所具有的活性酚羥基數(shù)量越少,極性越小,分子的親水性減弱[26]。同時(shí),原花青素聚合度越高,分子空間構(gòu)象越復(fù)雜,分子體積增大,與樹脂之間的作用點(diǎn)增多,需要更高濃度的乙醇溶液才能洗脫[27]。

姜倩等[28]采用AB-8大孔吸附樹脂分離肉桂原花青素,用體積分?jǐn)?shù)分別為10%、50%、70%、100%的乙醇溶液洗脫,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大,其洗脫液中原花青素的聚合度越高,另外,10%乙醇洗脫液中原花青素的抗氧化活性最強(qiáng),對(duì)DPPH·的清除率為0.91 g/L。朱靖蓉等[29]對(duì)比了AB-8、ADS-8和S-8型三種大孔吸附樹脂對(duì)原花青素分離純化的效果,結(jié)果表明,ADS-8大孔吸附樹脂對(duì)葡萄籽原花青素吸附能力最強(qiáng),產(chǎn)物純度大于95%,分離效果最好。白歡歡等[30]利用AB-8大孔吸附樹脂分離花生紅衣原花青素,結(jié)果發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為20%和40%的乙醇溶液洗脫得到的產(chǎn)物均為低聚原花青素,且均為A型原花青素。

另外,也有較多研究通過大孔吸附樹脂法與其他分離方法相結(jié)合的方式對(duì)原花青素進(jìn)行分離或分級(jí)。Sui等[31]通過AB-8柱層析和Toyopearl HW-40柱層析相結(jié)合制備荔枝皮中(-)-兒茶素和寡聚原花青素,結(jié)果表明表兒茶素和A型原花青素三聚體的產(chǎn)率最高。Dong等[32]以花生皮和柿子單寧裂解產(chǎn)物為原料,先后用AB-8柱層析、Toyopearl HW-40柱層析進(jìn)行洗脫,結(jié)果顯示二者所制備的A型原花青素寡聚體含量均較高。進(jìn)一步地,在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)A型和B型二聚體均具有較高的抗氧化能力,且呈劑量依賴性,一般情況下,B型二聚體相比于具有相同亞基的A型二聚體有更高的自由基清除能力,但在組織或脂質(zhì)系統(tǒng)中,A型二聚體與B型二聚體具有相似的抗氧化能力。大孔吸附樹脂法常用來分離制備A型低聚原花青素,分離效果較好,應(yīng)用廣泛,但其吸附效果易受樣品流速和溶質(zhì)濃度的影響,所得產(chǎn)物純度較低,在多種分離技術(shù)相結(jié)合的分級(jí)方式中,大孔吸附樹脂法常用作進(jìn)一步純化和初步分離。

1.3 葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱分離法

Sephadex LH-20是一種常用的葡聚糖凝膠填料,具有使用簡(jiǎn)便、產(chǎn)物純度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[33]。Sephadex LH-20的分級(jí)原理是在Sephadex LH-20柱中,組分極性越大,保留能力越弱,最先被洗脫,而原花青素隨著聚合度的增高,分子極性降低,因此低聚合度的原花青素先出柱,Sephadex LH-20柱能起到分配色譜的作用[34]。

Sephadex LH-20柱分離法是近幾年用于原花青素分離分級(jí)較多的方法。雷斗劍[35]利用Sephadex LH-20對(duì)火棘果原花青素提取物進(jìn)行分離,得到8種具有不同聚合度的原花青素組分,其聚合度范圍為5～16。Ling等[36]用Me2CO/H2O(7∶3)萃取蓮子房原花青素,后用Sephadex LH-20柱層析進(jìn)行分離,得到的產(chǎn)物純度大于98%,質(zhì)譜分析表明,該產(chǎn)物為原花青素單倍體、二聚體和四聚體的混合物,其中二聚體的含量最高。通過抑制脂氧合酶活性和對(duì)自由基清除率影響的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),0.1%的蓮子房原花青素產(chǎn)物在大豆油體系中具有較強(qiáng)的抗氧化活性,在相同濃度下優(yōu)于二丁基羥基甲苯。Fu等[37]從山竹果果皮中提取低聚原花青素,用Sephadex LH-20柱分離得到0.66%的產(chǎn)率(干物質(zhì)),且分離出的原花青素具有較強(qiáng)的過氧自由基清除能力,其清除能力為1.7×104μmol TE/g。Gong等[38]經(jīng)兩輪Sephadex LH-20柱層析分餾荔枝果皮得到S3片段,其進(jìn)一步分離得到四種不同的A型或B型表兒茶素低聚物,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這些低聚物的抗氧化活性和對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖的抑制作用均強(qiáng)于荔枝花青素。馬燁[39]用Sephadex LH-20柱分離純化后的紅米原花青素,得到平均聚合度為4.14的六個(gè)原花青素組分,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),平均聚合度在2.8～8.6范圍內(nèi)的前五個(gè)紅米原花青素組分抗氧化活性與聚合度呈正相關(guān),但平均聚合度為12.7的最后一個(gè)組分抗氧化活性顯著降低。

另外,也有較多研究通過Sephadex LH-20柱分離法與其他分離方法相結(jié)合的方式對(duì)原花青素進(jìn)行分離或分級(jí)。李倩[40]利用大孔吸附樹脂對(duì)南酸棗皮原花青素提取物進(jìn)行初純化,再利用不同濃度甲醇溶液,通過葡聚糖凝膠LH-20層析柱對(duì)南酸棗皮原花青素提取物進(jìn)行純化分級(jí),得到的五個(gè)原花青素組分平均聚合度為1.9～9.3。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),隨著原花青素組分平均聚合度的增加,其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和對(duì)α-淀粉酶、α-葡糖苷酶的抑制作用隨之增強(qiáng),但抗氧化活性隨之減弱,這可能是由于分子量大的原花青素,不易穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用。周蒙等[41]通過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱和快速蛋白液相色譜分離純化黑荊樹粗提物,得到純度大于90%、得率大于13%的黑荊樹原花色素二聚體,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該原花色素二聚體的抗氧化活性高于原花青素單體標(biāo)樣。Wiesneth等[42]將LH-20、MCI-、Diol-和RP-18-phases色譜聯(lián)合分離沙柳粗提物,制得原花青素B1、B2、B3、B4、C1、表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-兒茶素和表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素-(4β→8)-兒茶素等化合物。Hellenbrand等[43]開發(fā)了一種將Sephadex LH-20層析與制備高效液相色譜相結(jié)合的方式,對(duì)貫葉連翹中的金絲桃的丙酮-水提取物進(jìn)行分級(jí),得到聚合度從3到10的原花青素。Ito等[44]采用Sephadex LH-20柱層析和反相制備高效液相色譜法,從黑豆種皮中分離出原花青素低聚物(二聚物到四聚物)。Lepp?等[45]采用Sephadex LH-20柱層析法與半制備液相色譜相結(jié)合的方式,可控制性地從11種不同植物中分離出幾十個(gè)化學(xué)和色譜良好的PC組分。綜上所述,Sephadex LH-20柱分離法分級(jí)效果好,可分離低聚和高聚原花青素,但價(jià)格偏貴。

1.4 Toyopearl HW-40柱分離法

Toyopearl HW-40和Sephadex LH-20柱分離法一樣,也是一種常見的尺寸排阻色譜,在原花青素的分級(jí)中發(fā)揮著分子篩的作用,分級(jí)后所得產(chǎn)物純度較高。Toyopearl HW-40由乙烯醇和甲基丙烯酸酯共聚而成的半堅(jiān)硬的球狀體組成,相對(duì)而言,Sephadex LH-20柱價(jià)格更高,分級(jí)效果更好,很少研究報(bào)道單獨(dú)使用Toyopearl HW-40柱進(jìn)行分級(jí)。但二者尺寸不同,Toyopearl HW-40孔徑更小,是脫鹽的理想選擇,而Sephadex LH-20適用于天然產(chǎn)物在有機(jī)溶劑中的純化。Toyopearl HW-40對(duì)原花青素的分級(jí)原理是Toyopearl HW-40表面的-OH具有親水性,能吸附較多親水性官能團(tuán)[46]。不同聚合度的原花青素具有不同的分子量,而Toyopearl HW-40柱起到了分子篩的作用。Rosales-Castro等[47]用乙酸乙酯對(duì)西葫蘆樹皮粗提取物進(jìn)行液體分配,得到有機(jī)提取物,然后用柱層析法(Toyopearl HW-40F)分級(jí),在產(chǎn)物中檢測(cè)、鑒定出了聚合度分別為2、3、4的低聚原花青素,并通過測(cè)定發(fā)現(xiàn)這些低聚物具備較高的抗自由基活性。Rosales-Castro等[48]用相似的方法從杜鵑櫟樹皮中分離出低聚原花青素,均表現(xiàn)出最佳的抗氧化能力。

目前相對(duì)常見的是將Toyopearl HW-40柱分離法與其他分離方法相結(jié)合的方式對(duì)原花青素進(jìn)行分級(jí)。Kawahara等[49]用Amberlite XAD-1180N、Toyopearl HW40F和Sepacore C-18反相色譜柱相結(jié)合的方式將紅小豆中的原花青素濃縮成5個(gè)餾分,并鑒定這些組分分別為(表)兒茶素六聚物、七聚物和八聚物、沒食子兒茶素-(表)兒茶素五聚物和(表)沒食子兒茶素-(表)兒茶素六聚物。這些組分對(duì)人PC-3前列腺癌細(xì)胞具有顯著的抗癌活性,它們還能顯著抑制脂肪酸結(jié)合蛋白基因的表達(dá),該基因在前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。Sei-ichi等[50]采用相似的方法得出了相近的結(jié)果,其利用Amberlite XAD-1180N、Sephadex-LH-20、Toyopearl HW-40F和反相高效液相色譜對(duì)葡萄莖提取物中原花青素組分進(jìn)行了純化,并測(cè)定了兩種關(guān)鍵化合物為沒食子兒茶素-(表兒茶素)7沒食子酸鹽。其中沒食子兒茶素-(表兒茶素)7沒食子酸酯(化合物1)在PC-3前列腺癌細(xì)胞中具有顯著的抗癌活性。周瑋婧等[51]將荔枝皮原花青素浸提物通過AB-8大孔樹脂純化,并進(jìn)一步通過Toyopearl HW-40S樹脂層析分級(jí)處理,得到荔枝皮原花青素低聚體,其主要成分為(-)-表兒茶素、A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體。Schmidt等[52]以野藍(lán)莓為原料,分別采用Toyopearl和Sephadex LH-20柱層析法,采用液體真空法和開放柱層析法將其分離為富含原花青素的組分,得到的兩個(gè)原花青素組分平均聚合度為3.25和5.65,均能抑制引起尿路感染的大腸桿菌的粘附。另外,只有聚合度為5.65的部分對(duì)人前列腺和小鼠肝癌細(xì)胞系有明顯的抗增殖活性。Xiao等[53]將澳洲青蘋果(Granny Smith apples,GSE)粗提物通過ADS-17大孔樹脂柱純化,得到了該蘋果的原花青素提取物,并進(jìn)一步在Toyopearl TSK HW-40s柱上,按聚合度對(duì)GSE進(jìn)行了分級(jí),得到原花青素B2和C1。利用Toyopearl HW-40柱分離法與其他分離方法相結(jié)合的方式對(duì)原花青素進(jìn)行分級(jí),所得原花青素產(chǎn)物純度更高,分級(jí)效果更理想。

2 液-液色譜法制備原花青素

液-液色譜法是流動(dòng)相和固定相均為液體的分離方法,它依賴于PC在不同溶劑體系中分配系數(shù)的不同,常需要與液-固色譜法相結(jié)合來檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì),是目前分離分級(jí)原花青素較新的方法。

2.1 高速逆流色譜法(High-speed Countercurrent Chromatography,HSCCC)

高速逆流色譜法利用了一種特殊的流體動(dòng)力學(xué)(單向流體動(dòng)力學(xué)平衡)現(xiàn)象,使兩個(gè)互不相溶的溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管中單向分布,從而實(shí)現(xiàn)不同溶解分配系數(shù)的溶質(zhì)在兩相溶劑中的高效分離[54-55]。Shibusawa等[56]用HSCCC法以乙酸甲酯-水為1∶1的兩相溶劑體系,1.0 mL/min的洗脫速率從蘋果中分離原花青素,對(duì)各組分進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)原花青素按聚合度進(jìn)行分離,聚合度在5～13的原花青素含量最多,其次是原花青素單體,包括(+)兒茶素和(-)表兒茶素。Esatbeyoglu等[57]利用高速逆流色譜(HSCCC)成功從野櫻桃中分離出半合成反應(yīng)混合物,并發(fā)現(xiàn)HSCCC可在制備規(guī)模上分離純?cè)ㄇ嗨谺1[(-)-表兒茶素-4β→8-(+)-兒茶素]、B2[(-)-表兒茶素-4β→8-(-)-表兒茶素]、B5[(-)-表兒茶素-4β→6-(-)-表兒茶素]和B7[(-)-表兒茶素-4β→6-(+)-兒茶素]。Esatbeyoglu等[58]首次報(bào)道了利用高速逆流色譜法與其他逆流色譜法相結(jié)合的方式從可可豆中分離并半合成二聚到五聚的原花青素。Zhang等[59]報(bào)道在優(yōu)化的HSCCC條件下,葡萄籽原花青素可被分離為7個(gè)不同的組分,平均聚合度范圍為1.5～6.9,且原花青素抗氧化活性與DP值呈負(fù)相關(guān)。Li等[60]用高速逆流色譜法對(duì)可可豆中原花青素進(jìn)行分級(jí),餾分中原花青素聚合度范圍為1～5,二聚原花青素B2純度超過86%。通過抗氧化活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)原花青素的抗氧化活性隨著其聚合度的增加而降低。Peng等[61]通過實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),與以往方法相比,HSCCC在制備二聚原花青素方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。Luo等[62]采用HSCCC和prep-HPLC對(duì)葡萄籽亞硫酸降解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí),共獲得10種二聚和三聚原花青素,其純度和產(chǎn)率均較高。Bai等[63]采用高速逆流色譜法從葡萄籽高聚原花青素半合成產(chǎn)物中分離出三個(gè)餾分,并使用制備型HPLC分離出各個(gè)原花青素,獲得了13種B型原花青素,包括單體、二聚體和三聚體,其純度超過91%。

Kumar等[64]以新鮮茶樹葉片為原料,經(jīng)Sephadex LH-20層析和高速逆流層析得到含有四聚A型和B型原花青素組分。高速逆流色譜法應(yīng)用相對(duì)較多,其分級(jí)原花青素制得的產(chǎn)物純度和產(chǎn)率都較高,但其解吸率低,作為一種相對(duì)較新的分離純化技術(shù),仍有許多理論和實(shí)踐問題需要解決,另外,尚缺乏完善的設(shè)備條件,制備規(guī)模受到限制,不適合大規(guī)模生產(chǎn)。

2.2 漸進(jìn)溶劑沉淀法

漸進(jìn)溶劑沉淀法是指非極性的低分子烷烴溶劑對(duì)減壓渣油中的各組分具有不同的溶解度,利用溶解度的差異可以實(shí)現(xiàn)組分分離。Yang等[17]用漸進(jìn)溶劑沉淀從芒果果皮中制備寡聚原花青素,并對(duì)其進(jìn)行分餾。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)漸進(jìn)溶劑沉淀法可以直接純化聚合度值接近1的寡聚物。趙丹等[65]以葡萄皮原花青素為原料,采用漸進(jìn)溶劑沉淀法對(duì)其進(jìn)行分級(jí)處理,通過測(cè)定后發(fā)現(xiàn)隨著聚合度的增加,其抗氧化能力下降。漸進(jìn)溶劑沉淀法分級(jí)效果好,且不存在吸附損失,但操作復(fù)雜,應(yīng)用較少。

3 結(jié)論

原花青素的生理活性與其聚合度、羥基的數(shù)量及位置、單體的連接方式和空間構(gòu)型等息息相關(guān),分離和制備不同聚合度的原花青素一直以來是研究的熱點(diǎn)[66]?？偨Y(jié)之前的研究可以發(fā)現(xiàn):

許多不同的分離方法已被用于原花青素的分級(jí),每種分離方法各有優(yōu)劣。

相比于高聚合度的原花青素,低聚原花青素的分級(jí)制備更受關(guān)注。這可能是因?yàn)橹参矬w內(nèi)的原花青素常以高聚形式存在,分級(jí)制備高聚原花青素相對(duì)簡(jiǎn)單。更重要的是,高聚原花青素的分子量較大,受空間位阻影響,酚羥基活性受到影響。

目前對(duì)原花青素的分級(jí)很少采用單一的分離方式,在原花青素的分級(jí)中,常見的方法是連續(xù)采用多種液-固色譜法,或者是采用液-固色譜法和液-液色譜法相結(jié)合的方式[67]。這是因?yàn)椴捎脝我坏姆蛛x方式,分級(jí)效果不理想,所得分級(jí)產(chǎn)物聚合度不集中,純度較低。采用多種分離方法相結(jié)合的方式能最大程度發(fā)揮每一種方法的作用,達(dá)到進(jìn)一步純化或細(xì)分的目的。

在分級(jí)制備得到不同聚合度的原花青素之后,有部分文獻(xiàn)報(bào)道了繼續(xù)測(cè)定不同聚合度原花青素的生理活性,但絕大多數(shù)局限于測(cè)定不同聚合度原花青素的抗氧化和抗癌活性。一般而言,原花青素聚合度越高,抗氧化活性越低,而抗癌活性隨之增強(qiáng),這可能與原花青素羥基的數(shù)量和位置以及空間構(gòu)型有關(guān)。

雖然目前對(duì)原花青素進(jìn)行分級(jí)的研究較多,但是鮮有研究報(bào)道能夠分離制備出具有單一聚合度純度較高的原花青素,這仍然是目前研究的難點(diǎn),且原花青素與聚合度的構(gòu)效關(guān)系尚不明確。未來可以從以下方面進(jìn)行深入研究:

每種分離方法在分級(jí)制備不同聚合度的原花青素中各有優(yōu)劣,綜合考慮各種方法,揚(yáng)長(zhǎng)避短,優(yōu)化分級(jí)方式,以期達(dá)到最佳分級(jí)效果。

制備純度較高的單一聚合度的原花青素,在此基礎(chǔ)上研究原花青素的抗氧化、抗癌、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等生理活性與其聚合度的關(guān)系,明確原花青素與聚合度的構(gòu)效關(guān)系,以期提高原花青素的利用率。