DHA藻油毒理學(xué)研究進(jìn)展

蘭 韜,汪志明,趙 琳,陸姝歡,舒 敏,李翔宇,*

(1.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所,北京 100191; 2.嘉必優(yōu)生物工程(武漢)有限公司,湖北武漢 430073)

二十二碳六烯酸藻油(Docosahexaenoic acid algal oil,DHA藻油)是采用裂壺藻(Schizochytriumsp.)或者吾肯氏壺藻(Ulkeniaamoeboida)或者寇氏隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)等藻種為原料[1-2],經(jīng)生物發(fā)酵、提取、冬化、精制、脫色、除臭等過程制得富含DHA的油脂[3-4]。

DHA藻油中所含的DHA是一種對人體非常重要的ω-3不飽和脂肪酸[5]。它是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長及維持的一種主要成分,是大腦和視網(wǎng)膜的重要組成成分,對胎嬰兒智力和視力發(fā)育至關(guān)重要[6-7],同時還有降低心腦血管疾病風(fēng)險[8-10],緩解抑郁癥的功效[11]。DHA可以由α-亞麻酸合成,也可以直接從母乳、魚油或藻油中獲得[12]。其中DHA藻油具有DHA含量高、無重金屬污染、EPA含量較低、安全易吸收等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[13]。

DHA藻油除了富含DHA外,還含有4%～5.6%的二十二碳五烯酸(DPA)以及19種飽和脂肪酸酯和24種不飽和脂肪酸酯等[14],還有一些不可皂化的角鯊烯、甾醇和類胡蘿卜素。其中DPA(ω-6)是人體飲食中的正常組成成分,牛肉、雞肉、蛋、豬肉以及大量海產(chǎn)品中都含有DPA。DHA所含的其他脂肪酸組分也較為安全,角鯊烯、甾醇和類胡蘿卜素等也都是常見的食品添加劑。所以可以認(rèn)為DHA藻油中各主要成分基本都是安全的[15]。

目前DHA藻油已被廣泛應(yīng)用于配方乳粉、保健食品等產(chǎn)品中,但其加工過程涉及藻類自然發(fā)酵過程,這一過程產(chǎn)生了DHA、DPA等重要營養(yǎng)物質(zhì),也增加了一定的安全風(fēng)險。因此對DHA藻油的毒理學(xué)評價十分必要。而且目前還沒有對DHA藻油安全使用上限進(jìn)行完整研究的報道。為確保其安全使用,本文將對DHA藻油的主要成分、臨床前動物毒理學(xué)研究、臨床毒理學(xué)研究進(jìn)行介紹,確定DHA藻油的安全使用上限,以及作為食品原料需要注意的關(guān)鍵控制點(diǎn),為監(jiān)管部門、相應(yīng)生產(chǎn)企業(yè)制定和推薦DHA藻油的日使用量提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 DHA藻油的毒理學(xué)研究

1.1 臨床前動物毒理學(xué)研究

DHA藻油臨床前動物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究以裂壺藻、吾肯氏壺藻、寇氏隱甲藻為研究對象,主要實(shí)驗(yàn)動物以大鼠為主,具體包括急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、亞急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、亞慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)等。研究中大多以生長情況、血液指標(biāo)、臨床化學(xué)參數(shù)、大體病理學(xué)和組織病理學(xué)等作為考核指標(biāo),評估實(shí)驗(yàn)動物食用DHA藻油后的安全性。下面按急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、亞急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、短期毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、亞慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、生殖毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)等方面分別進(jìn)行論述。

1.1.1 急性和亞急性毒理學(xué)研究 急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)是對化合物毒理學(xué)安全性評價的首要工作,可以了解機(jī)體一次或24 h內(nèi)多次接觸該外源化合物后,在短期內(nèi)(一般4～14 d)引起的中毒效應(yīng),在不同類型化學(xué)物的法規(guī)制定程序中是必做實(shí)驗(yàn)[16]。急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)主要測定半數(shù)致死量(LD50),確定化合物的中毒方式、中毒反應(yīng),并為亞急性和慢性中毒實(shí)驗(yàn)的觀察指標(biāo)及劑量分組提供參考。亞急性毒性實(shí)驗(yàn)是指機(jī)體在24 h～28 d內(nèi)多次或連續(xù)暴露于外源化合物后出現(xiàn)的不良反應(yīng)。檢驗(yàn)受試驗(yàn)物質(zhì)(添加劑)的毒性對機(jī)體的重要器官或生理功能的影響,并估量發(fā)生影響的劑量,為慢性毒性試驗(yàn)做準(zhǔn)備[17]。

目前有較多DHA藻油原料都申請了美國FDA(Food and Drug Administration)的GRAS(Generally Recognized as Safe)食品,同時DHA藻油原料在申請我國國內(nèi)新食品原料過程中,急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是必須提供的。鑒于此,DHA藻油的急性和亞急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究也較多,DHA藻油的急性和亞急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)論見表1。從表1可以看出,用寇氏隱甲藻和裂壺藻來源的DHA藻油在最高20000 mg/kg/bw的劑量下飼喂大鼠和豬14 d后,動物的生長、發(fā)育、血常規(guī)、尿常規(guī)、解剖后均未發(fā)現(xiàn)異常,說明對于大鼠和豬，其LD50大于20000 mg/kg/bw,寇氏隱甲藻和裂壺藻兩種來源的DHA藻油沒有表現(xiàn)出急性和亞急性毒性,這兩種來源的DHA藻油屬于實(shí)際無毒級別。

1.1.2 亞慢性和慢性毒理學(xué)研究 亞慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)是機(jī)體在連續(xù)較長時間(相當(dāng)于1/10生命周期,對于大鼠一般是90 d)接觸不同較大劑量(低于LD50)外源化合物后所產(chǎn)生的毒理學(xué)效應(yīng)。慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)是確定外來化合物的毒理學(xué)下限,即長期接觸該化合物可以引起機(jī)體危害的閾劑量和無作用劑量,對于大鼠一般是120 d。為進(jìn)行該化合物的危險性評價與制定人接觸該化合物的安全限量標(biāo)準(zhǔn)提供毒理學(xué)依據(jù),如最高容許濃度和每日容許攝入量等[24]。本文對DHA藻油動物亞慢性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計和結(jié)論進(jìn)行了綜述,列于表2中,從表2中可以看出，寇氏隱甲藻、裂壺藻、吾肯氏壺藻三種藻種來源的DHA藻油在2000～4260 mg/kg/bw的喂食劑量下,飼喂大鼠90～120 d,大鼠沒有出現(xiàn)死亡,體重,食物消耗,行為,血液學(xué),臨床化學(xué),凝血或尿分析等參數(shù)未見異常,說明三種常見來源的DHA藻油的大鼠LD50大于4260 mg/kg/bw,三種常見來源的DHA藻油沒有表現(xiàn)出亞慢性和慢性毒性。

1.1.3 生殖、發(fā)育和遺傳毒理學(xué)研究 生殖、發(fā)育和遺傳毒性也是食品原料安全性的重要指標(biāo)。多項(xiàng)研究證明DHA藻油沒有表現(xiàn)出生殖毒理學(xué)和發(fā)育毒理學(xué)。補(bǔ)充DHA藻油的樣品組和對照組相比,體現(xiàn)生殖能力的發(fā)情周期持續(xù)時間、生育率、妊娠長度和每胎幼崽數(shù)等參數(shù)沒有明顯差異。雌性動物接觸DHA藻油后,新生子代從出生到斷奶期間均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)上顯著的劑量依賴不良反應(yīng)。大鼠或兔的子代器官發(fā)育、著床后胎兒死亡概率、平均胎兒體重或胎兒畸形情況沒有較大差異。一些研究采用體外或體內(nèi)研究方法評估了DHA藻油的遺傳毒理學(xué),所有致突變性和基因毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性,可認(rèn)為DHA藻油無遺傳毒理學(xué)。

表1 DHA藻油動物急性和亞急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果Table 1 Results of the acute and subacute animal oral toxicity tests of DHA algal oil

表2 DHA藻油動物亞慢性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果Table 2 Results of the sub-chronic and chronic animal oral toxicity tests of DHA algal oil

DHA藻油對于動物的生殖、發(fā)育和遺傳毒性研究結(jié)果表述見表3。從表3中可以看出,裂壺藻、寇氏隱甲藻、吾肯氏壺藻三種藻種來源的DHA藻油以最高20700 mg/kg/bw的喂食劑量飼喂大鼠,大鼠的發(fā)情周期,交配性能,生育力,妊娠期,分娩和妊娠指數(shù)、產(chǎn)仔數(shù)、后代體重、F1代的生理發(fā)育等生殖參數(shù)均沒有表現(xiàn)出異常,說明DHA藻油的無害作用劑量(NOAEL)可達(dá)20700 mg/kg/bw,可認(rèn)為其沒有生殖毒性和發(fā)育毒性。

對幾種大鼠細(xì)胞進(jìn)行了DHA藻油的給藥實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)DHA藻油在給藥劑量為1000～5000 mg/kg時,沒有表現(xiàn)出致突變作用、骨髓毒性和遺傳毒性。

表3 DHA藻油動物生殖、發(fā)育和遺傳毒理學(xué)研究結(jié)果Table 3 Results of the reproductive,developmental and genetic animal oral toxicity tests of DHA algal oil

表4 DHA藻油臨床毒理學(xué)研究結(jié)果Table 4 Results of clinical toxicology of DHA algal oil

1.2 臨床毒理學(xué)研究

本文對裂壺藻來源的DHA藻油的臨床毒理學(xué)進(jìn)行了匯總列于表4中。多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究證明,DHA藻油在最高6000 mg/d的給藥劑量下,對人體無不良反應(yīng),添加DHA藻油后的嬰兒配方乳粉不會顯著影響嬰兒的生長。成人攝取DHA藻油后[34-40],攝入DHA不會對血小板功能或凝血產(chǎn)生不利影響,不會增加脂質(zhì)過氧化,低劑量的DHA對免疫功能無影響,而基于DHA介導(dǎo)的某些免疫細(xì)胞功能在DHA攝入水平升高時受到抑制,當(dāng)DHA攝入水平升高時,個體感染的風(fēng)險可能更高。對于高血壓糖尿病患者,攝取劑量超過4000 mg/d的DHA后,對短期血糖控制有不良影響。

在最近的一項(xiàng)為期120 d的臨床研究中[41],足月兒在14～120 d的時間內(nèi)被喂養(yǎng)含DHA配方乳粉(17 mg DHA/100 kcal)以評估對生長和耐受性的影響。在120 d的年齡段內(nèi),各性別的生長率沒有顯著差異。這項(xiàng)研究表明了DHA藻油對嬰兒的臨床安全性和耐受性。

綜上所述,DHA藻油對動物體和人體在較高的劑量范圍都是安全的。

2 DHA藻油產(chǎn)品質(zhì)量關(guān)鍵控制點(diǎn)

目前對于DHA藻油的動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)均建立在產(chǎn)品質(zhì)量合格的DHA藻油原料基礎(chǔ)上,但DHA藻油的產(chǎn)品質(zhì)量也存在一些關(guān)鍵控制點(diǎn),包括重金屬和儲存條件等,若相應(yīng)的關(guān)鍵控制點(diǎn)出現(xiàn)問題,也將影響DHA藻油產(chǎn)品質(zhì)量,甚至產(chǎn)生毒副作用。

2.1 重金屬

DHA藻油主要采用培養(yǎng)海藻生產(chǎn)不飽和脂肪酸的微生物培養(yǎng)法。對于藻油來源的DHA,主要是在密閉的發(fā)酵罐中進(jìn)行DHA的生產(chǎn)和富集,原料來源可控,本團(tuán)隊采集了10種市售的DHA藻油樣品,并進(jìn)行了鉛、砷、汞等重金屬含量的檢測,結(jié)果顯示這些藻油中均未檢出常見的重金屬,說明DHA藻油在重金屬方面沒有明顯安全隱患,應(yīng)更加關(guān)注加工過程中其他外源性風(fēng)險指標(biāo)的控制[42-43]。

2.2 儲存條件

DHA屬于ω-3多不飽和脂肪酸,極易被氧化變質(zhì),氧化后的ω-3多不飽和脂肪酸食品會形成過不飽和脂肪酸食品,從而失去其商業(yè)和營養(yǎng)價值[44-45]。若長期過多攝入多不飽和脂肪酸油脂,會引起體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)上升和抗氧化酶活性降低[46-48],引發(fā)炎癥、動脈粥樣硬化、癌變[49-51]等。由于DHA藻油中含有豐富的胡蘿卜素類物質(zhì),所以DHA藻油具有很好的抗氧化效果,但在正常的生產(chǎn)和儲運(yùn)過程中,依然需要注意增加適量的抗氧化劑(如維生素E、抗壞血酸棕櫚酸酯等)[52-53],以保證原料的功能性和安全性。

3 總結(jié)

本文對DHA藻油的急性、亞急性、亞慢性、慢性、生殖、臨床毒理學(xué)文獻(xiàn)進(jìn)行了梳理,發(fā)現(xiàn)裂壺藻、吾肯氏壺藻、寇氏隱甲藻三種藻源發(fā)酵來源的DHA藻油在最高20700 mg/kg/bw劑量范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出相應(yīng)的毒性,DHA藻油在最高6000 mg/d的給藥劑量下,對人體無不良反應(yīng),嬰兒攝取添加DHA藻油后的嬰兒配方乳粉不會顯著影響嬰兒的生長。DHA藻油作為食品原料，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注加工過程中其他外源性風(fēng)險指標(biāo)的控制,同時在儲運(yùn)貯藏過程中,應(yīng)注意增加適量的抗氧化劑(抗壞血酸棕櫚酸酯和維生素E)以保證原料的功能性和安全性。本文梳理的結(jié)果對于監(jiān)管部門、相應(yīng)生產(chǎn)企業(yè)制定和推薦DHA藻油的日使用量提供了數(shù)據(jù)依據(jù)。