預制調(diào)理低嘌呤大菱鲆魚片的制備及品質(zhì)研究

孫 宏,李婷婷,宋敏杰,趙貴琴,勵建榮,*

(1.渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013; 2.大連民族大學生命科學學院,遼寧大連 116600)

大菱鲆,英文Turbot音譯而成,即歐洲比目魚,在中國稱之為“多寶魚”,主要分布在大西洋東側(cè)歐洲沿岸等地,被國際認為是高價值的食用魚類[1]。我國現(xiàn)有渤海、黃海、東海和南海四大海區(qū)漁場,遼寧省作為我國大菱鲆養(yǎng)殖第一大省,養(yǎng)殖年產(chǎn)量達到2.2 萬噸,占全國大菱鲆養(yǎng)殖面積的一半左右[2]。

大菱鲆含有豐富的高營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、Ω-3脂肪酸和DNA[3],符合消費者對深海水產(chǎn)品營養(yǎng)的需求。每天食用200 g的大菱鲆魚,就可以滿足一個成年人一天所需蛋白質(zhì)含量的一半以上[4]。人體血尿酸正常含量為200～410 umol/L[5],Kaneko根據(jù)嘌呤含量的多少將食物分為極低、低、中度、高和極高嘌呤食物五個等級,極低組:<50 mg/100 g,低組:50～100 mg/100 g,中度組:100～200 mg/100 g,高組:200～300 mg/100 g,極高組:>300 mg/100 g[6]。其中極低嘌呤食物包括谷類、蔬菜、雞蛋以及乳制品,低嘌呤食物包括菌菇和部分加工肉,中等嘌呤含量的食物包括部分肉制品及大部分水產(chǎn)品,而大菱鲆中所含嘌呤含量高達111.94 mg/100 g[7]。對于嘌呤脫除的食物主要集中在啤酒[8-9]及豆制品[10-11]中,而對于畜禽水產(chǎn)品中嘌呤的脫除主要是通過簡單地加工[12-13]進行。呂兵兵[14]對帶魚分別進行水煮、清蒸和油炸加工處理,實驗表明,水煮處理可以有效脫除嘌呤。任麗琨[15]通過對大菱鲆進行香辛調(diào)味料(大蒜粉、生姜粉、花椒粉、桂皮茴香)溶液浸泡處理,研究表明,這五種調(diào)味料均可有效脫除嘌呤,且大蒜粉、花椒粉、生姜粉浸泡處理的魚肉嘌呤脫除效果最佳,并對大菱鲆進行大蒜素浸泡-水煮處理,研究表明,大菱鲆魚片經(jīng)大蒜素浸泡,清水水煮處理,嘌呤脫除率高達70%。因此通過浸泡-水煮處理,脫除嘌呤,開發(fā)獨具特色的功能性調(diào)理水產(chǎn)品,可以提高產(chǎn)品受眾范圍,能夠有效促進水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)朝著健康的方向發(fā)展。

鑒于目前對于水產(chǎn)品中嘌呤檢測的方法沒有明確的統(tǒng)一的標準,常用的方法包括色譜、電泳以及離子交換法。其中高效液相色譜因其高效、高速、高靈敏度的特點,使用最為廣泛。因此本文基于高效液相色譜法,通過外源添加花椒粉浸泡魚片并結(jié)合水煮處理的方法,對處理前后的樣品嘌呤含量進行了檢測,以制備低嘌呤調(diào)理魚片。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活大菱鲆(Scophthalmusmaximus) 遼寧省錦州市林西市場,每條凈重750～1000 g?；ń贩?Zanthoxylumbungeanum) 中國吉林省杞參食品有限公司;腺嘌呤(Adenine)、鳥嘌呤(Guanine)、次黃嘌呤(Hypoxanthine)、黃嘌呤(Xanthine)、四丁基氫氧化氨(10%于純水中)、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、冰乙酸(Glacial acetic acid) 均為色譜純,純度≥99.0%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超純水(Milli-Q Ultra-pure water) 美國Millipore公司;甲酸(Formic acid,FAC) 分析純,天津市福晨化學試劑有限公司。

SK6210HP型超聲清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;JYL-C012型絞肉機 九陽股份有限公司;DK-BD型電熱恒溫水槽 上海恒一科技有限公司;MS105DU型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司;LC-2030型島津高效液相色譜儀 日本島津;Biofuge Stratos型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司。

1.2 嘌呤含量的測定

1.2.1 標準曲線的繪制 參考宋敏杰等[16]的方法稍作調(diào)整,分別稱取0.0120 g腺嘌呤、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤定容至10 mL,配置成濃度為1200 mg/L的標準儲備液(1 mol/L的NaOH助溶)備用。隨后用超純水將四種嘌呤標準樣品稀釋配制成300、200、100、50、5、0.5、0.1 mg/L的標準液。所有待測樣品過0.22 μm濾膜,在選定的色譜條件下進行嘌呤含量測定,得到峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)、樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)做線性回歸方程。

1.2.2 色譜條件 色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse C18Plus(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速0.6 mL/min;柱溫25 ℃;進樣量6.0 μL;檢測波長254 nm。將冰乙酸、四丁基氫氧化銨、超純水按體積比1.5∶1.5∶997混合作為流動相a,再與甲醇(流動相b)按95∶5混合作為最終流動相。

1.2.3 樣品處理和測定 采用Qu等[17]測定嘌呤的方法,稍作修改。稱取0.20 g樣品置于50 mL離心管中。加入三氟乙酸及甲酸各10 mL,混合后90 ℃水浴加熱12 min,然后置于80 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,殘余物用流動相A復溶,取復溶后的液體過0.22 μm濾器后上機檢測。

1.2.4 方法學考察 在此進一步通過方法學驗證的方式探究其在本實驗中的可行性。方法精密度:利用已確定的色譜方法對同一混標連續(xù)進樣6次,進樣量為6 μL,計算相對標準偏差(RSD),確定高效液相色譜方法的精密度(RSD)。重復性驗證:取四種嘌呤的單一儲備液,各自連續(xù)進樣測定6次,計算四種嘌呤物質(zhì)各自的相對標準偏差(RSD),確定儀器精密度。

1.3 預制調(diào)理低嘌呤大菱鲆魚片的制備

1.3.1 工藝流程 在傳統(tǒng)調(diào)理魚片加工工藝[16]的基礎上,增加嘌呤脫除工藝,制得預制低嘌呤調(diào)理魚片。低嘌呤大菱鲆調(diào)理魚片加工工藝流程:魚→取背部魚肉→脫除嘌呤→調(diào)味→包裝→儲藏。

1.3.2 操作要點

1.3.2.1 魚片的前處理 將鮮活的大菱鲆運回實驗室用碎冰猝死,去除內(nèi)臟,沿椎骨剖開取背部魚片,用水沖洗干凈,瀝水,取魚背部肌肉,并切成體積大小為6 cm×3 cm×2 cm規(guī)格的魚片[18]。

1.3.2.2 嘌呤脫除與加工 通過在添加有一定量的花椒粉溶液中浸泡一定時間后取出魚肉,移至沸水中水煮一定時間,對魚肉中的嘌呤含量進行脫除。

1.3.2.3 調(diào)味、包裝、儲藏 加入食鹽2.5%,蔗糖1.5%,蔥汁1.5%,蒜汁1.5%,香菜汁1.5%,料酒4.0%,制得調(diào)味液[19]。均勻的涂抹在加工過的魚片上,真空包裝[20],4 ℃冷藏貯藏。

1.3.3 花椒粉溶液浸泡對大菱鲆嘌呤含量影響 預實驗結(jié)果表明,浸泡溫度對嘌呤的影響較小,因此后續(xù)實驗均在25 ℃條件下進行。

1.3.3.1 浸泡時間的選擇 將20.00 g的樣品(背部魚肉)于2%的花椒粉水溶液中分別浸泡0、15、30、45、60 min,測定嘌呤含量。

1.3.3.2 花椒粉添加量的選擇 將20.00 g的樣品(背部魚肉)于0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的花椒粉水溶液中浸泡20 min,測定嘌呤含量。清水浸泡為對照。

1.3.4 花椒粉水溶液水煮對大菱鲆嘌呤含量影響

1.3.4.1 生熟肉轉(zhuǎn)化系數(shù)的確定 經(jīng)水煮加工的水產(chǎn)品,組織中的汁液易流出,從而質(zhì)量減小,以致于影響嘌呤含量的準確性,引起誤差[21-22],為此,采用王新宴等[21]的方法計算生熟肉轉(zhuǎn)化系數(shù),減少誤差。將20.00 g普通魚肉在清水中煮0、2、4、6、8、10、12、14 min。稱量各個時間點熟肉質(zhì)量,計算生熟肉轉(zhuǎn)換系數(shù)(F)[24],計算公式如下:

F=熟肉質(zhì)量/生肉質(zhì)量

熟肉中嘌呤含量=樣品中嘌呤含量×轉(zhuǎn)換系數(shù)

1.3.4.2 水煮時間對大菱鲆嘌呤含量影響 將2%的花椒粉加入到200 mL水中至沸騰，取20.00 g未浸泡魚肉置于沸水中繼續(xù)加熱,并于0、2、4、6、8、10、12、14 min時對大菱鲆進行感官評分并測定嘌呤含量。

以清水為對照組,在200 mL水沸騰時，取20.00 g未浸泡魚肉置于沸水中繼續(xù)加熱,并于0、2、4、6、8、10、12、14 min時測定嘌呤含量[25]。

1.3.4.3 感官評定 對魚塊進行浸泡、水煮處理之后,借用五名經(jīng)過專業(yè)訓練的感官評價員,采用5人評價法,對錫箔紙包裹著的熟魚片從肌肉組織彈性、色澤、氣味的變化、滋味口感得濃郁程度進行感官評價,感官評價表如表1所示。

表1 水煮時間對大菱鲆感官的影響Table 4 Effect of boiling time on the sensory sense of turbot

1.3.5 浸泡-水煮處理對嘌呤含量的影響 將20.00 g魚肉在2%的花椒粉溶液中浸泡45 min后,置于清水中煮8 min,測其嘌呤含量。

1.3.6 嘌呤脫除率的計算

嘌呤脫除率(%)=(a-b)/a

式中:a:未經(jīng)處理樣品中嘌呤含量,g;b:花椒粉浸泡并清水水煮處理后樣品嘌呤含量,g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗都重復三次,結(jié)果表示為平均值±標準偏差,數(shù)據(jù)處理使用軟件Excel 2007和SPSS 17.0,繪圖采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘌呤含量的測定

2.1.1 標準曲線 由表2可知,該方法在0.1～300 mg/L的范圍內(nèi)線性關系良好,決定系數(shù)(R2)均大于0.999。符合實驗要求。

表2 嘌呤標準曲線Table 2 Standard curves of purine

表3 精密度實驗結(jié)果Table 3 The precision results

2.1.2 方法學驗證 由于檢測儀器的型號、廠家等客觀因素能夠?qū)︵堰蕶z測的準確性造成一定的影響,因此進一步通過方法學驗證的方式對所采用的實驗方法進行驗證,以確保實驗結(jié)果的準確性。對同一混標連續(xù)進樣測定6次,結(jié)果如表3所示,四種嘌呤物質(zhì)測得相對標準偏差(RSD)在0.1199%～0.4393%,表明儀器精密度良好。

重復性實驗結(jié)果顯示(表4),四種嘌呤的峰面積的RSD分別為4.2983%、4.3827%、2.1970%、4.3859%,該方法重復性良好(RSD<5%),適用于嘌呤檢測。

2.2 嘌呤的脫除

2.2.1 花椒粉溶液浸泡對大菱鲆嘌呤含量影響

表4 重復性實驗Table 4 Repeatability test

表5 浸泡時間對各嘌呤含量的影響Table 5 Effect of soaking time on the content of each purine

表6 花椒粉添加量對各嘌呤含量的影響(mg/100 g)Table 6 Effect of Pepper powder addition on the content of each purine(mg/100 g)

2.2.1.1 浸泡時間的確定 表5為不同浸泡時間對大菱鲆嘌呤含量的影響,大菱鲆經(jīng)花椒粉水溶液浸泡60 min時,嘌呤含量總體呈下降趨勢。在0～15 min內(nèi),三種嘌呤均迅速減少,腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤分別減少33.3148、7.7079、9.3622 mg/100 g。15 min以后,嘌呤減少速度逐漸緩慢,最后趨于穩(wěn)定,結(jié)果與任麗琨[15]一致。且在15 min時嘌呤總含量減少了50.9448 mg/100 g,嘌呤脫除率達到60.47%,45 min時嘌呤含量最低,因此選擇45 min為最佳浸泡時間。新鮮的大菱鲆中未檢測到黃嘌呤,可能是因為背部魚肉中黃嘌呤含量本來就少,且黃嘌呤易溶于水[26]。

2.2.1.2 花椒粉添加量的確定 表6為不同花椒粉添加量對大菱鲆嘌呤含量的影響,隨著花椒粉添加量的增加,嘌呤含量總體呈現(xiàn)先下降后緩慢升高的趨勢,腺嘌呤、次黃嘌呤均是如此,黃嘌呤因其含量較低仍然無法檢出,其中腺嘌呤和次黃嘌呤變化最為顯著,在花椒粉添加量達到2.0% 時,嘌呤總含量達到最低為42.3889 mg/100 g,嘌呤脫除率達到32.14%,推測可能與花椒粉中的某些活性成分有關[27]。之后嘌呤總含量呈現(xiàn)緩慢上升趨勢,進行顯著性分析,表明1.5%、2.0%、2.5%、3.0%之間的嘌呤含量差異不顯著。因此實驗最終選擇2.0%的花椒粉為最佳添加量。

2.2.2 水煮時間對大菱鲆嘌呤含量影響

2.2.2.1 生熟肉轉(zhuǎn)化系數(shù)結(jié)果 魚肉在0、2、4、6、8、10、12、14 min時的轉(zhuǎn)化系數(shù)分別為 1.000、0.939、0.857、0.802、0.771、0.746、0.730、0.707。隨著水煮時間的增長,汁液流出,肌肉組織斷裂損失,所以質(zhì)量越來越小。

2.2.2.2 水煮時間對大菱鲆感官得分的影響 圖1為水煮過程中大菱鲆的感官得分,隨著水煮時間的增加,大菱鲆魚腥味逐漸減弱,特有的香氣變得越來越濃郁,生肉感逐漸消失,口感逐漸變得細膩,因此風味、口感得分越來越高,而肉質(zhì)由于加熱致使肌肉纖維收縮,使得魚肉越來越?jīng)]有彈性,且逐漸變得不完整[28],外觀得分越來越低。

圖1 水煮過程中大菱鲆感官得分Fig.1 Sensory scores of the cooked turbot with boiling

2.2.2.3 水煮時間對大菱鲆嘌呤含量影響 圖2為水煮時間對嘌呤含量的影響,隨著水煮時間的延長,嘌呤含量均呈現(xiàn)下降趨勢,推測可能是由于隨著水煮時間的增加,流動水滲入到魚肉組織內(nèi)部對嘌呤進行了稀釋。有研究表明,隨著溫度的增加,魚肉中肌纖維收縮,肌束空隙擴大,不易流動水向自由水轉(zhuǎn)變,使肌肉組織中的自由水含量增大[29],從而引起嘌呤溶出。

圖2 水煮時間對嘌呤含量影響Fig.2 Effects of cooking time on the content of purine

與空白組相比,實驗組嘌呤總含量僅減少6.94%,即單純花椒粉水溶液水煮對其嘌呤含量的影響不大,說明在嘌呤脫除過程中各工序存在協(xié)同作用。推測可能是因為在水煮加工過程中嘌呤的變化主要由熱萃取作用引起。且次黃嘌呤相對較容易溶于湯中,腺嘌呤次之,鳥嘌呤最難[30]。

結(jié)合圖1水煮過程中大菱鲆感官得分以及圖2水煮時間對嘌呤含量的影響,最終選擇水煮加工的最佳時間為8 min。

2.2.3 浸泡-水煮處理對嘌呤含量的影響 圖3為浸泡-水煮對嘌呤含量的影響,與新鮮大菱鲆相比,利用清水對大菱鲆進行浸泡并且加熱煮沸處理,能夠使嘌呤含量減少58.07%；而以花椒粉對大菱鲆進行浸泡加熱處理,與新鮮大菱鲆相比嘌呤總含量減少了79.50%,與清水浸泡-清水水煮過的空白組相比嘌呤含量降低了21.43%,推測可能是因為魚肉中含較多的次黃嘌呤,而花椒粉中的有效成分可促進黃嘌呤氧化酶的活性,進而使次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,黃嘌呤易溶于熱水[31],從而脫除嘌呤。由此可知,通過花椒粉浸泡-清水水煮的方式加工處理可以顯著降低大菱鲆中的嘌呤含量。進而制得本文中預制低嘌呤魚片。

圖3 浸泡-水煮對嘌呤含量的影響Fig.3 Effect of soaking-boiled on the content of purine注:不同小寫字母代表同一指標 不同組之間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

本實驗以高效液相色譜法為檢測方法,通過用天然香辛料花椒粉溶液浸泡-清水水煮魚片的方式,脫除魚片中的嘌呤,結(jié)果顯示通過用2%的花椒粉浸泡魚片45 min,再用清水煮沸8 min,可得到低嘌呤調(diào)理魚片。與清水浸泡-清水水煮過的空白組相比嘌呤含量降低了21.43%,基于此,花椒粉浸泡結(jié)合清水水煮的加工方式可有效脫除嘌呤,實驗所研制的魚片,提高了感官品質(zhì),拓寬了產(chǎn)品受眾范圍,進一步促進水產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。由于花椒粉成分復雜,花椒粉對嘌呤的脫除機理鮮有報道,起到主要作用的成分還有待進一步研究。后續(xù)可以嘗試通過虛擬篩選、分子對接等現(xiàn)代化手段探究花椒粉中嘌呤相關的活性成分以及作用方式。