氣相色譜法測定河粉中脫氫乙酸含量的不確定度評定

□ 楊鈺瑩 吳雅麗 廣東省食品工業(yè)公共實驗室 廣東省食品工業(yè)研究所有限公司 廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗站

隨著人們生活水平的提高，人們對食品種類的需求更加多元化，這大大促進(jìn)了食品添加劑的生產(chǎn)和應(yīng)用。近年來，由于我國不斷出現(xiàn)食品重大安全事故，越來越多的人關(guān)注“餐桌上的安全”。鑒于食品安全的重要性，我國對食品安全的把控越來越嚴(yán)。脫氫乙酸是在保存食品過程中運(yùn)用最為廣泛的食品防腐劑之一，主要以鈉鹽的形式存在，是一種高效、廣譜、低毒的食品防腐劑，對霉菌、酵母等具有較強(qiáng)的抑菌作用，廣泛應(yīng)用于面包、糕點、醬腌菜、果蔬汁飲料等食品的生產(chǎn)、加工及保藏過程[1]。根據(jù)相關(guān)毒理實驗，脫氫乙酸及其鈉鹽在一定劑量下可產(chǎn)生潛在毒性作用，降低仔代體重、抑制骨骼發(fā)育，對人體內(nèi)臟有一定損傷[2]。

河粉作為廣東人民鐘愛的特色傳統(tǒng)美食之一，一般由大米洗凈后碾磨成粉，加水調(diào)制成糊狀，蒸成片狀，冷卻分割為條狀制成。《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB2760—2014）將河粉歸類為米粉制品，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定米粉制品不得添加脫氫乙酸，然而一些不良商家為了更好地保存河粉，延長貯藏期，在河粉里面添加脫氫乙酸。本文根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）和《測量不確定度評定以表示》（JJF 1059.1—2012）分析河粉中脫氫乙酸含量的不確定度，為更好地服務(wù)食品安全監(jiān)管工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

氣相色譜儀（Agilent 7890 A，安捷倫公司）；十萬分之一天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司）；千分之一天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；離心機(jī)（曦瑪離心機(jī)揚(yáng)州有限公司）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

乙酸乙酯和正己烷（霍尼爾公司）；鹽酸、硫酸鋅和氫氧化鈉（廣州化學(xué)試劑廠）；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.9%，BePure）。

1.3 實驗方法

1.3.1 試劑配制

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50.05 mg于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶解定容，備用[3]。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別精確吸取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.01 mL、0.10 mL、0.50 mL、1.00 mL和2.00 mL于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋并定容，配制成濃度為1.00 μg/mL、10.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 和200.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，備用[3]。

1.3.2 測定方法

稱取樣品，置于50 mL離心管中，加入約15 mL水、2.5 mL硫酸鋅溶液（120 g/L），用氫氧化鈉溶液（20 g/L）調(diào)PH至7.5，超聲提取15 min，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水定容。樣液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入5 mL正己烷，振蕩1 min，靜置分層后取下層樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液，加1 mL鹽酸溶液（體積比為1∶1）酸化后，準(zhǔn)確加入5.0 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，靜置分層，取樣品溶液供氣相色譜測定[3]。

1.3.3 色譜條件

起始溫度150 ℃，以10 ℃/min升至210 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升至240 ℃保持4 min；進(jìn)樣口及檢測器溫度分別為240 ℃、300 ℃；載氣氮氣流速為1.0 mL/min；分流進(jìn)樣，分流比為5∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL[3]。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

式中，X—樣品中脫氫乙酸含量，g/kg；C—樣品溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，μg/mL；V1—樣品處理后容量瓶定容體積，mL；V3—乙酸乙酯定容體積，mL；m樣—待測樣品的取樣量，g；V2—取脫氫乙酸所取試樣液體積，mL；1 000—單位換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

脫氫乙酸含量的不確定度主要來源于：①配制標(biāo)準(zhǔn)溶液過程引入；②樣品稱量過程引入；③樣品前處理過程中稀釋定容引入；④標(biāo)準(zhǔn)曲線引入；⑤重復(fù)性測量引入，具體見圖1。

2.2 計算不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品由BePure提供，該標(biāo)物濃度為99.9%，擴(kuò)展不確定度為2.0%，按正態(tài)分布k=2，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對不確定度分別為：

圖1 脫氫乙酸含量的不確定度來源

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

十萬分之一天平稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品50.05 mg，用乙酸乙酯定容至50.00 mL。該天平的檢定證書給出的擴(kuò)展不確度為U=0.04 mg(k=2)，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

根據(jù)《測量不確定度評定以表示》（JJF 1059.1—2012）可知，50 mLA級單標(biāo)線容量瓶的容量允許差為±0.05 mL[4]，均勻分布其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

玻璃器皿在室溫20 ℃校準(zhǔn)，實驗室的溫度在（20±5）℃變動。該影響引起的不確定度可通過計算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來評定。由于液體的體積膨脹明顯大于玻璃器皿的體積膨脹，因此溫度變化引入不確定度只需考慮前者即可。查得乙酸乙酯的體積膨脹系數(shù)為1.38×10—3℃—1，由溫度波動引起的體積偏差為V×10 ℃×1.38×10—3℃—1，均 勻 分 布由溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)合成相對不確定度為：

2.2.2 樣品稱量過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱取混合均勻的樣品5.000 g，使用千分之一的天平稱量，該天平檢定證書給出的0～50 g（0～5 000 e，e=10 d，d=1 mg）稱量范圍的允許誤差為MPE=±5mg，均勻分布用5 g法碼校正天平，該法碼檢定證書給出的擴(kuò)展不確度為Us=0.03 (k2=2)。稱量樣品河粉6次，結(jié)果分別為5.023 g、5.023 g、5.021 g、5.022 g、5.022 g和5.022 g，均值為5.022 g，方差為S2=0.000 000 567。其合成樣品稱量過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.2.3 樣品前處理過程中稀釋定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.3.1 樣品處理后容量瓶定容體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品經(jīng)搗樣處理后，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水定容。由《測量不確定度評定以表示》（JJF 1059.1—2012）可知，25 mLA級容量瓶的容量允許差為±0.03 mL[4]，均勻分布其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為分別為：

溫度變化引入不確定度參照2.2.1.2，查得水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10—4℃—1，由溫度波動引起的體積偏差為V1×10 ℃×2.08×10—4℃—1，均勻分布由溫度變化引入的相對不確定度和合成樣品處理后容量瓶定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.2.3.2 萃取脫氫乙酸所取樣液體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品經(jīng)處理定容后，取10 mL上清液。由《測量不確定度評定以表示》（JJF 1059.1—2012）可知，10 mL移液槍在10 mL檢定點的容量允許誤差為±0.6%[5]，均勻分布，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

溫度變化引入不確定度參照2.2.1.2，查得水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10—4℃—1，由溫度波動引起體積偏差為V2×10 ℃×2.08×10—4℃—1，均勻分布由溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定和合成萃取脫氫乙酸所取試樣液體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定分別為：

2.2.3.3 乙酸乙酯定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品經(jīng)前處理后，最后用5 mL分度吸管移取5 mL乙酸乙酯定容，由《測量不確定度評定以表示》（JJF 1059.1—2012）可知，5 mL分度吸管的容量允許差為±0.025 mL[4]，均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

溫度變化引入不確定度參照2.2.1.2，查得乙酸乙酯的體積膨脹系數(shù)為1.38×10—3℃—1，由溫度波動引起體積偏差為V3×10 ℃×1.38×10—3℃—1，均勻分布由溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和乙酸乙酯定容體積引入的合成相對不確定度分別為：

綜合上述，樣品前處理過程中稀釋定容的相對不確定度為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

使用校準(zhǔn)曲線計算脫氫乙酸的濃度，配制6個校準(zhǔn)溶液點，其濃度分別 為1.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00μg/mL和200.00 μg/mL，均值為c標(biāo)=61.0 μg/mL，每個點各測3次，結(jié)果見表1。

根據(jù)表1進(jìn)行線性回歸方程式擬合，結(jié)果見表2。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和峰面積測定結(jié)果（n=3）

表2 線性范圍和檢出限

由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度為：

式中：S—標(biāo)準(zhǔn)曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差；Aj—標(biāo)準(zhǔn)溶液脫氫乙酸濃度對應(yīng)峰面積；a—標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；cj—標(biāo)準(zhǔn)溶液脫氫乙酸濃度點，μg/mL；n—標(biāo)準(zhǔn)溶液測定次數(shù)；p—樣品測定次數(shù)。

測量提取溶液兩次的濃度分別為1.057 μg/mL和1.082 μg/mL，均 值為1.070 μg/mL，由此可得，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度時產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.5.1 儀器重復(fù)性引入的不確定度

同一個樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，分別得出脫氫乙酸的含量為0.002 64 g/kg、0.002 65 g/kg、0.002 65 g/kg、0.002 62 g/kg、0.002 62 g/kg和0.002 65 g/kg，均值為0.002 64 g/kg。測量的重復(fù)性以標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，按貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)偏差，儀器測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5.2 其他因素重復(fù)性引入的不確定度

影響檢測結(jié)果重復(fù)性的因素主要有測量儀器的變動性、檢驗人員操作、讀數(shù)差異和樣品不均勻等因素[6]。對重復(fù)性測量條件下得到的一系列測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，即可得各種隨機(jī)因素合并引起的重復(fù)性不確定度。

檢驗員使用同一臺儀器，在重復(fù)性條件下對同一批次的河粉進(jìn)行了6次重復(fù)試驗，測得脫氫乙酸含量分別為0.002 64 g/kg、0.002 73 g/kg、0.002 82 g/kg、0.002 68 g/kg、0.002 77 g/kg和0.002 85 g/kg，均值為0.002 75 g/kg，測量的平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

綜上所述，測量重復(fù)性引入的相對不確定度為：

2.2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

綜合上述5個方面引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得到合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

當(dāng)置信概率為95%時，取包含因子k=2，相對擴(kuò)展不確定度為：

Urel=k×ucrel(W)=2×0.388=78%

由于待檢測樣品脫氫乙酸含量的測定結(jié)果為未檢出，選擇該標(biāo)準(zhǔn)下的脫氫乙酸的檢出限做為考慮絕對值含量，其檢出限為0.001 g/kg，則其擴(kuò)展不確定度為U=0.001 g/kg×78%=0.000 78 g/kg。

3 結(jié)論

本文研究得出，河粉中的脫氫乙酸含量的測定結(jié)果為未檢出），在95%置信區(qū)間下，其擴(kuò)展不確定度為0.000 78 g/kg（k=2）。綜上所述，不確定度是由多種因素共同影響下構(gòu)成的，每個環(huán)節(jié)因素都對結(jié)果產(chǎn)生影響，所以應(yīng)提高檢測人員的實際操作能力，減少檢驗過程中稱量、配制等關(guān)鍵環(huán)節(jié)過程產(chǎn)生的誤差，避免重復(fù)計算不確定度因素，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。