芥子堿硫氰酸鹽對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制研究

蘇羽屾 曾智銳 榮冬蕓 王葉 李丹 唐姍姍 汪濤 龍雪梅 曹煜

中圖分類號 R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）08-0952-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.10

摘 要 目的：研究芥子堿硫氰酸鹽（ST）對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和轉(zhuǎn)移的影響，并考察其可能的作用機(jī)制。方法：將人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞分為空白對照組（0.1%二甲基亞砜）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L），分別通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷染色實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，通過Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)分別測定各組細(xì)胞中EMT相關(guān)指標(biāo)N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏著蛋白（E-cadherin）的表達(dá)水平。另將SCL-1細(xì)胞分為空白對照組（0.1%二甲基亞砜）、ST單用組（20 μmol/L）、ST+NSC228155組[20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155（EGFR激動劑）]和ST+SC79組[20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79（PI3K/Akt激動劑）]，分別通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，并通過Western blot實(shí)驗(yàn)測定空白對照組（0.1%二甲基亞砜）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L）組細(xì)胞中表皮生長因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白的表達(dá)水平，以驗(yàn)證ST的作用與EGFR/PI3K/Akt信號通路的關(guān)系。另將SCL-1細(xì)胞和人正常皮膚成纖維細(xì)胞WS1分別分為空白對照組（0.1%二甲基亞砜）、 ST組（20 μmol/L）、 ZD1839組（陽性對照，20 μmol/L，EGFR抑制劑）和LY294002組（陽性對照，20 μmol/L，PI3K/Akt抑制劑），采用CCK-8實(shí)驗(yàn)測定各組細(xì)胞的增殖能力，以評價(jià)ST的細(xì)胞毒性。結(jié)果：與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著減弱（P<0.05）;Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5、10、20 μmol/L ST組SCL-1細(xì)胞中N-cadherin蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)（P<0.05），E-cadherin蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.05），并且細(xì)胞中EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與ST單用組比較，ST+NSC228155組和ST+SC79組SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)（P<0.05）。與空白對照組比較，ST組WS1細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），SCL-1細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P<0.05），ZD1839組和LY294002組兩種細(xì)胞的增殖能力均顯著減弱（P<0.05）;與ST組比較，ZD1839組和LY294002組WS1細(xì)胞的增殖能力均顯著減弱（P<0.05），但SCL-1細(xì)胞的增殖能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：ST可能通過抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路的活化而抑制人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移，且其毒副作用較小。

關(guān)鍵詞 芥子堿硫氰酸鹽;人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞;增殖;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;轉(zhuǎn)移;EGFR/PI3K/Akt信號通路

Study on the Effects and Its Mechanism of Sinapine Thiocyanate on the Proliferation， Epithelial Mesenchymal Transition and Metastasis of Human Cutaneous Squamous Cell Carcinoma SCL-1 Cells

SU Yushen1，2，ZENG Zhirui3，4，RONG Dongyun1，2，WANG Ye1，2，LI Dan1，2，TANG Shanshan1，2，WANG Tao1，2， LONG Xuemei1，2，CAO Yu1，2（1. School of Clinical Medicine， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 2. Dept. of Dermatology， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 3. Dept. of Physiology， School of Basic Medical Science， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China; 4. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pathogenesis&Drug Research on Common Chronic Diseases， Guiyang 550004， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of sinapine thiocyanate （ST） on the proliferation， epithelial mesenchymal transformation （EMT） and metastasis of human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1 cells， and to investigate its possible mechanism. METHODS： Human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1 cells were divided into blank control group （0.1% DMSO） and ST different concentration groups （5， 10， 20? ? ? μmol/L）. CCK-8 assay， 5-ethynyl-2′-deoxyuridine （EDU） test， scratch test and Transwell chamber invasion test were adopted to test the proliferation， migration and invasion ability. The expression of N-cadherin and E-cadherin were detected by Western blot and immunofluorescence assay. Other SCL-1 cells were collected and divided into blank control group （0.1% DMSO）， ST group （20 μmol/L）， ST+NSC228155 group [20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155 （EGFR agonist）] and ST+SC79 group [20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79 （PI3K/Akt agonist）]. The proliferation， migration and invasion ability of SCL-1 cells in each group were detected by CCK-8 assay， scratch test and Transwell chamber invasion assay. The expression of epidermal growth factor receptor （EGFR）， phosphatidylinositol 3 kinase （PI3K）， phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase （p-PI3k）， protein kinase B （Akt） and phosphorylated protein Akt （p-Akt） protein of cells in blank control group and ST different concentration groups （5， 10， 20 μmol/L） were determined by Western blot assay so as to validate the relationship between ST effect and EGFR/PI3K/Akt signaling pathway. SCL-1 cells and human normal skin fibroblasts cell WS1 were divided into blank control group （0.1% DMSO）， ST group （20 μmol//L）， ZD1839 group （positive control， 20 μmol//L， EGFR inhibitor） and LY294002 group （positive control， 20 μmol//L， PI3K/Akt inhibitor）. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation in order to evaluate the cells cytotoxicity of ST. RESULTS： Compared with blank control group， the proliferation， migration and invasion ability of SCL-1 cells were significantly decreased in 5， 10， 20 μmol/L ST groups （P<0.05）. Western blot and immunofluorescence assay showed that the expression of N-cadherin in SCL-1 cells were decreased significantly in 5， 10， 20 μmol/L ST groups （P<0.05）， while the protein expression of E-cadherin was increased significantly （P<0.05）; the protein expressions of EGFR， p-PI3K and p-Akt were significantly decreased （P<0.05）. Compared with ST group， the proliferation， migration and invasion ability of SCL-1 cells were increased significantly in ST+NSC228155 group and ST+SC79 group （P<0.05）. Compared with blank control group， the proliferation ability of WS1 cells had no significant change in ST group， while the proliferation ability of SCL-1 cells was decreased significantly （P<0.05）; the proliferation ability of the two kinds of cells were decreased significantly in ZD1839 group and LY294002 group （P<0.05）. Compared with ST group， the proliferation ability of WS1 cells was decreased significantly in ZD1839 group and LY294002 group （P<0.05）， but there was no significant difference in the proliferation ability of SCL-1 cells （P>0.05）. CONCLUSIONS： ST may inhibit the proliferation， EMT and metastasis of SCL-1 cells through inhibiting the activation of EGFR/PI3K/Akt signaling pathway， and its side effects are few.

KEYWORDS? ?Sinapine thiocyanate; Human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1 cells; Proliferation; Epithelial mesechymal transition; Metastasis; EGFR/PI3K/Akt signaling pathway

皮膚鱗狀細(xì)胞癌多為表皮腫瘤，常采用手術(shù)方法進(jìn)行治療，但治療后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移;復(fù)發(fā)后，多采用放化療方法進(jìn)行治療，治療風(fēng)險(xiǎn)較高[1-2]。因此，尋找一種安全的新型藥物對于治療復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性皮膚鱗狀細(xì)胞癌較為重要。皮膚鱗狀細(xì)胞癌易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）是其轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一[3]。EMT是細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的過程，其與多種細(xì)胞生物的正常胚胎發(fā)育相關(guān)，但同時(shí)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4]。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展過程中，原柱狀的正常上皮細(xì)胞會逐漸變?yōu)樗笮蔚拈g質(zhì)細(xì)胞，此時(shí)上皮細(xì)胞的極性消失，失去了原本與基底膜連接的上皮表型特征，從而獲得遷移、侵襲、抗凋亡等間質(zhì)表型功能[5]。

表皮生長因子受體（EGFR）是細(xì)胞增殖、發(fā)育所必需的受體[6]。當(dāng)表皮生長因子與其配體在細(xì)胞外結(jié)合后形成二聚體，此二聚體可使細(xì)胞內(nèi)酪氨酸發(fā)生磷酸化并激活下游細(xì)胞內(nèi)的信號級聯(lián)，激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途徑[7]，而該途徑與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等惡性行為密切相關(guān)[8]。

芥子堿硫氰酸鹽（ST）是從十字花科藥用植物中提取得到的一種木脂素類化合物，具有抗炎、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[9]，具有較大的開發(fā)價(jià)值。有報(bào)道指出，ST能夠抑制小鼠的血脂血糖升高、動脈粥樣硬化和肝細(xì)胞脂肪變性[10-11];此外，ST對肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有抑制作用[12]。然而，ST對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的影響及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探討ST對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞增殖、EMC和轉(zhuǎn)移的影響，并從EGFR/PI3K/Akt信號通路出發(fā)初步分析其分子作用機(jī)制，為ST藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)以及將其用于臨床治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌提供可行的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

HHM-SY96S型多功能酶標(biāo)儀購自深圳恒美生物科技有限公司;54-03003型倒置光學(xué)顯微鏡購自德國Bresser公司;GelDoc XR型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;LV100ND型熒光顯微鏡購自日本Nikon公司;DYCP-31DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀均購自北京六一生物科技有限公司;D-650型水平細(xì)胞超凈工作臺購自江蘇常州如益科技有限公司;303-5B型二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海尚儀生物科技有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

ST原料藥（批號7431-77-8，純度>98%）購自成都儀睿生物科技有限公司;EGFR激動劑NSC228155、PI3K/Akt激動劑SC79、EGFR抑制劑ZD1839和PI3K/Akt抑制劑LY294002（批號分別為HY-101084、HY- 18749、HY-50895、HY-10108，純度均大于99%）均購自美國MCE公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶[含乙二胺四乙酸（EDTA）]溶液均購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒（批號BS350A）購自上海白鯊生物科技有限公司;Transwell小室（批號30419069）購自美國Corning公司;Matrigel膠（批號2446ML005）購自德國Biofroxx公司;苯甲基磺酰氟（PMSF）、RIPA裂解液均購自福州飛凈生物科技有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）凝膠試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）定量試劑盒（批號分別為MA0388-08F、MA0082-02C）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;兔源EGFR、PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（批號分別為25869、60225、10176、12789、22018）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;兔源N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）多克隆抗體、鼠源E-鈣黏著蛋白（E-cadherin）單克隆抗體、鼠源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號分別為GB111009、GB12868、GB12001）均購自武漢塞維爾生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（批號分別為AS014、AS003）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EDU）增殖檢測試劑盒（批號C0088L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ECL高敏曝光液（批號36222ES60）購自武漢聚能慧達(dá)生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司，人正常皮膚表皮纖維細(xì)胞WS1購自美國ATCC細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

將SCL-1細(xì)胞和WS1細(xì)胞分別用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基（后文簡寫為“完全培養(yǎng)基”）在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至融合度約90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）溶液對其進(jìn)行消化、傳代，取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（本研究所用的為傳代6～10代的細(xì)胞）。

2.2 ST對SCL-1細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將SCL-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）溶液消化7 min后，以1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，制成密度均為4×103 mL-1的單細(xì)胞懸液，按每孔100 μL接種到96孔板中。將細(xì)胞分為空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，下同）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L，以完全培養(yǎng)基配制，藥物濃度均根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，下同），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔;并另設(shè)不加細(xì)胞和藥物的調(diào)零孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞充分貼壁后，每孔加入相應(yīng)藥液或完全培養(yǎng)基100 μL。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，按每孔100 μL加入CCK-8溶液（將CCK-8溶液與RPMI 1640培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 9混合）;作用3 h后，采用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔的光密度（OD）值并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率：增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-調(diào)零孔OD值）/（空白對照組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。去掉3次實(shí)驗(yàn)中的最大值和最小值，將其余所有數(shù)據(jù)均用于統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.2 EDU染色實(shí)驗(yàn) 將SCL-1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）溶液消化8 min后，以1 000 r/min離心5 min，吸棄上清液，收集細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，制成密度為2×105 mL-1的細(xì)胞懸液。在6孔板中鋪上無菌蓋玻片，并按每孔200 μL加入細(xì)胞懸液。將細(xì)胞分為空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L），每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。每組細(xì)胞中加入EDU溶液（按RPMI 1640培養(yǎng)基和EDU原液體積比1 000 ∶ 1稀釋）1.9 mL和相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基100 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h，根據(jù)EDU增殖檢測試劑盒說明書方法對其進(jìn)行洗片、固定、染色、DAPI染核等操作。隨后，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，分別計(jì)數(shù)每視野下的陽性細(xì)胞數(shù)（即出現(xiàn)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)），并計(jì)算陽性細(xì)胞率：每視野下的陽性細(xì)胞率（%）=每視野下陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，每組均取平均值作為檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

2.3 ST對SCL-1細(xì)胞遷移能力的影響

采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。按“2.2.2”項(xiàng)下方法對SCL-1細(xì)胞進(jìn)行消化、離心和重懸。將細(xì)胞懸液按每孔1 mL接種至6孔板中，并按每孔1 mL加入完全培養(yǎng)基，吹打混勻后，將細(xì)胞分為空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞融合度達(dá)95%以上時(shí)，用200 μL移液槍槍頭在每孔細(xì)胞中劃3條線。以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后，分別加入RPMI 1640培養(yǎng)基1.9 mL和相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基100 μL。在加藥培養(yǎng)的0、24 h時(shí)，分別在倒置光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對進(jìn)行拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件測量各孔劃痕的面積并計(jì)算各組細(xì)胞的相對遷移率：相對遷移率（%）=（實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)0 h時(shí)的劃痕面積-實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)24 h時(shí)的劃痕面積）/（空白對照組培養(yǎng)0 h的劃痕面積-空白對照組培養(yǎng)24 h時(shí)的劃痕面積）×100%，每組均取平均值作為檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

2.4 ST對SCL-1細(xì)胞侵襲能力的影響

采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。將Matrigel膠和不含血清的培養(yǎng)基按體積比1 ∶ 8混勻，均勻鋪在Transwell小室的上室，在37 ℃培養(yǎng)箱中將Matrigel烘干，棄掉多余的培養(yǎng)基。按“2.2.2”項(xiàng)下方法對SCL-1細(xì)胞進(jìn)行消化、離心并收集細(xì)胞，然后將細(xì)胞用完全培養(yǎng)基重懸，制成密度為4×105 mL-1的細(xì)胞懸液。吸取上述細(xì)胞懸液100 μL到Transwell小室的上室，下室加入完全培養(yǎng)基700 μL。將細(xì)胞分為空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞均按每孔100 μL加入相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基。將小室置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，再以4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS漂洗5 min×2次;用1%結(jié)晶紫試劑染色15 min，PBS漂洗5 min×2次。擦拭掉非侵襲細(xì)胞后將小室放入烘箱中烘干，然后在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察各孔侵襲的細(xì)胞，每個(gè)小室隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行拍照后進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值作為檢測結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

2.5 ST對SCL-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 Western blot實(shí)驗(yàn) 將SCL-1細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶（含EDTA）溶液消化7 min后，以1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。按“2.2.2”項(xiàng)下方法將細(xì)胞重懸，然后按每孔2 mL將細(xì)胞接種至6孔板中，將其分為空白對照組（含0.1%DMSO）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L）。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后，每孔加入相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;吸棄培養(yǎng)基，按每孔100 μL加入體積比1 ∶ 100的PMSF和RIPA裂解液的混合液，于冰上裂解15 min，然后在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸取蛋白上清液，并采用BCA蛋白定量法進(jìn)行蛋白定量。取變性后的蛋白20 μg行10%SDS-PAGE（電壓85 V，時(shí)間2 h），再以320 mA恒流2 h轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上。以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加入E-cadherin、N-cadherin、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;TBST溶液漂洗15 min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 2 000），室溫孵育2 h;TBST溶液漂洗3次×15 min，加入ECL曝光液后，于凝膠成像儀中成像。以Image Lab 5.2.0軟件測定目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）的條帶灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法對SCL-1細(xì)胞進(jìn)行消化、離心和重懸，然后按每孔100 μL接種到預(yù)先放有蓋玻片的6孔板中，并加入完全培養(yǎng)基2 mL，吹打混勻。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，以PBS清洗細(xì)胞爬片5 min×3次，然后將細(xì)胞分為空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）和ST不同濃度組（5、10、20 μmol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞均按每孔100 μL加入相應(yīng)藥液/完全培養(yǎng)基。將細(xì)胞再次置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用PBS浸洗3 min×3次，用4%多聚甲醛溶液固定爬片15 min，以PBS浸洗5 min×3次，用0.3%TritonX-100試劑室溫通透25 min，以PBS浸洗5 min×3次，將爬有細(xì)胞的蓋玻片倒扣在載玻片上，在每個(gè)蓋玻片上滴山羊血清室溫封閉30 min后，吸掉多余封閉液，分別加入N-cadherin、E-cadherin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;PBS浸洗3 min×3次，避光加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 100），室溫孵育1 h;以PBS浸洗3 min×3次，用DAPI復(fù)染核5 min;以PBS浸洗3 min×3次，吸水紙吸干多余液體，然后用含熒光猝滅劑的封片液封片。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，用Image Pro Plus 6.0軟件測定各組細(xì)胞每視野下的熒光強(qiáng)度并計(jì)算其相對熒光強(qiáng)度：相對熒光強(qiáng)度（%）=各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞每視野下平均熒光強(qiáng)度/空白對照組細(xì)胞每視野下平均熒光強(qiáng)度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理同“2.2.1”項(xiàng)。

2.6 ST是否通過EGFR/PI3K/Akt信號通路影響SCL-1細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究

2.6.1 加入EGFR/PI3K/Akt信號通路激動劑后對ST生物學(xué)效應(yīng)的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）、ST組（20 μmol/L）、ST+NSC228155組[20 μmol/L ST+100 μmol/L NSC228155]和ST+SC79組[20 μmol/L ST+20 μmol/L SC79]，分別按“2.2.1”“2.3”“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并檢測SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理同“2.1.1”項(xiàng)。

2.6.2 細(xì)胞中EGFR/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)采用 Western blot法進(jìn)行檢測。按“2.7”項(xiàng)下方法對細(xì)胞進(jìn)行分組、給藥、電泳和轉(zhuǎn)膜等操作。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別加入EGFR、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;TBST溶液漂洗15 min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1 ∶ 2 000），室溫孵育2 h;TBST溶液漂洗15 min×3次，加入ECL曝光液后，于凝膠成像儀中成像。以Image Lab 5.2.0軟件測定目標(biāo)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（EGFR以β-actin為內(nèi)參，p-PI3K以PI3K為內(nèi)參，p-Akt以Akt為內(nèi)參）的條帶灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 ST的細(xì)胞毒性考察

分別將SCL-1、WS1細(xì)胞分為空白對照組（含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基）、ST組（20 μmol/L）、EGFR抑制劑ZD1839組（陽性對照，20 μmol/L）和 PI3K/Akt抑制劑LY294002組（陽性對照，20 μmol/L），按“2.2.1”項(xiàng)下方法檢測細(xì)胞的增殖能力，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ST對SCL-1細(xì)胞增殖的影響結(jié)果

3.1.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞的增殖率均顯著降低（P<0.05），且ST的作用具有明顯的濃度依賴性（P<0.05）。各組SCL-1細(xì)胞增殖率的測定結(jié)果見表1。

3.1.2 EDU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組的細(xì)胞陽性率均顯著降低（P<0.05），且ST的作用具有一定的濃度依賴性趨勢，其中20 μmol/L ST組的細(xì)胞陽性率顯著低于5、10 μmol/L ST組（P<0.05）。各組SCL-1細(xì)胞的EDU染色圖見圖1（圖中，EDU表示陽性細(xì)胞，DAPI表示細(xì)胞核，Merge表示兩者的熒光合并圖），陽性細(xì)胞率的測定結(jié)果見表1。

3.2 ST對SCL-1細(xì)胞遷移的影響結(jié)果

與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞的相對遷移率均顯著降低（P<0.05），且ST的作用具有一定的濃度依賴性趨勢，其中10、20 μmol/L ST組細(xì)胞的相對遷移率顯著低于5 μmol/L ST組（P<0.05）。各組SCL-1細(xì)胞遷移能力觀察的顯微圖見圖2，相對遷移率的測定結(jié)果見表1。

3.3 ST對SCL-1細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果

與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組的侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P<0.05），且ST的作用具有一定的濃度依賴性趨勢，其中20 μmol/L ST組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于5、10 μmol/L ST組（P<0.05）。各組細(xì)胞侵襲能力觀察的顯微圖見圖3，侵襲細(xì)胞數(shù)的測定結(jié)果見表1。

3.4 ST對SCL-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果

3.4.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），N-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），且ST的作用具有明顯的濃度依賴性（P<0.05）。各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的電泳圖見圖4，表達(dá)水平的測定結(jié)果見表2。

3.4.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05），N-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05），且ST的作用具有明顯的濃度依賴性（P<0.05），該結(jié)果與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。各組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)的免疫熒光圖見圖5（圖中，E-cadherin、N-cadherin表示蛋白表達(dá)，DAPI表示細(xì)胞核，Merge表示兩者的熒光合并圖），表達(dá)水平的測定結(jié)果見表2。

3.5 ST是否通過EGFR/PI3K/Akt信號通路影響SCL-1細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的研究結(jié)果

3.5.1 加入EGFR/PI3K/Akt信號通路激動劑后對ST抑制SCL-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響結(jié)果 與空白對照組比較，各藥物組細(xì)胞的增殖率、相對遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低（P<0.05）。與ST組比較，ST+NSC228155組和ST+ SC79組細(xì)胞的增殖率、相對遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著升高（P<0.05），表明EGFR激動劑NSC228155和PI3K/Akt激動劑SC79均可逆轉(zhuǎn)ST對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用，這提示ST可能是通過EGFR/PI3K/Akt信號通路而發(fā)揮其對SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用。加入EGFR/PI3K/Akt信號通路激動劑后對ST抑制SCL-1細(xì)胞遷移、侵襲能力影響的顯微圖見圖6，增殖、遷移、侵襲能力影響的測定結(jié)果見表3。

3.5.2 ST對SCL-1細(xì)胞中EGFR/ PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果 與空白對照組比較，5、10、20 μmol/L ST組細(xì)胞中EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），且具有明顯的濃度依賴性（P<0.05）。各組細(xì)胞中EGFR、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)的電泳圖見圖7，表達(dá)水平的測定結(jié)果見表4。

3.6 ST的細(xì)胞毒性考察結(jié)果

與空白對照組比較，ST組WS1細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且SCL-1細(xì)胞的增殖率顯著降低（P<0.05）;而ZD1839組、LY294002組WS1、SCL-1細(xì)胞的增殖率均顯著降低（P<0.05）。與ST組比較，ZD1839組、LY294002組WS1細(xì)胞的增殖率均顯著降低（P<0.05），而SCL-1細(xì)胞的增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上結(jié)果提示，在等濃度下，ST的細(xì)胞毒性較陽性藥EGFR抑制劑ZD1839和PI3K/Akt抑制劑LY294002小，說明ST是一種藥效明顯且較為安全的藥物。各藥物對WS1細(xì)胞和SCL-1細(xì)胞增殖影響的測定結(jié)果見表5。

4 討論

當(dāng)前，皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療方法主要是手術(shù)、放化療結(jié)合等[1-2]。然而，患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率較高，且存在較多的并發(fā)癥[13]。中藥在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中晚期甚至是術(shù)后恢復(fù)不良患者的治療中發(fā)揮著重要作用，其具有毒副作用小等優(yōu)勢，能夠適當(dāng)?shù)匮娱L患者的生存期等[14]。本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、EDU染色實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用5、10、20 μmol/L的ST處理后，SCL-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著減弱，且其作用具有一定的濃度依賴性趨勢。EMT過程中常見的標(biāo)志物改變有上皮性蛋白（如E-cadherin、緊密連接蛋白、細(xì)胞角蛋白）表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)性蛋白（如N-cadherin、纖維連接蛋白、波形蛋白）表達(dá)上調(diào)[15]。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)及免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ST能夠顯著上調(diào)SCL-1細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin的表達(dá)，并下調(diào)N-cadherin蛋白的表達(dá)，且其作用具有一定的濃度依賴性趨勢。

相關(guān)臨床研究顯示，2例患有慢性粒細(xì)胞白血病且同時(shí)患有皮膚鱗狀細(xì)胞癌的患者在使用EGFR抑制劑伊馬替尼治療后疾病得到了緩解，提示EGFR可能與皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[16]。本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ST能夠抑制SCL-1細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá)。EGFR信號通路可影響PI3K/Akt等多種下游效應(yīng)分子的活化，由EGFR介導(dǎo)的p-PI3K（PI3K的活化形式）及其下游分子p-Akt（Akt的活化形式）增多能夠顯著促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的多種惡性生物學(xué)行為（如異常增殖、EMT以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等）[17-18]。本研究結(jié)果顯示，ST還能夠顯著抑制SCL-1細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt的表達(dá)。

為進(jìn)一步探討ST對SCL-1細(xì)胞惡性生物行為學(xué)的抑制是否是通過EGFR/PI3K/Akt信號通路來介導(dǎo)的，本課題組以認(rèn)可度高的EGFR激動劑NSC228155和PI3K/Akt激動劑SC79為研究工具[19]，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NSC228155、SC79均能夠減弱ST對SCL-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。此外，與最為經(jīng)典的EGFR通路抑制劑ZD1839和PI3K/Akt通路抑制劑LY294002相比[15]，ST對SCL-1細(xì)胞增殖的抑制作用沒有差異，但其對正常WS1細(xì)胞的毒副作用明顯要小。

綜上所述，ST對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌SCL-1細(xì)胞的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移均有明顯的抑制作用，且其對正常WS1細(xì)胞的毒副作用較小;ST抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用可能是與抑制EGFR/PI3K/Akt信號通路的活化有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2020-10-13 修回日期：2021-02-01）

（編輯：林 靜）