紅花PAL家族全基因組分析及其在懸浮細胞中的表達

郭英男，劉月?lián)P，馬靜雨，張 敬，馬鑫彤，張馨月，劉建雨，姚 娜，劉秀明，李海燕

吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118

紅花Carthamus tinctoriusL.為菊科紅花的干燥管狀花。辛、溫，歸心、肝經(jīng)。氣微香，味微苦。具有活血通經(jīng)、散瘀止痛功效。主治經(jīng)閉、痛經(jīng)、胸痹心痛、跌撲損傷和瘡瘍腫痛等[1]?！侗静菥V目》記載紅花汁與血同類，“故能行男子血脈，通女子經(jīng)水。多則行血，少則養(yǎng)血”[2]?，F(xiàn)代藥理、臨床研究證明，紅花具有擴張血管、抗凝血、抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、保護心腦血管、保護神經(jīng)、降壓和增強免疫等活性[3-6]。紅花花瓣最主要的活性化學成分是黃酮類化合物，主要分為黃酮類、黃酮醇類、醌式查耳酮類和二氫黃酮類。醌式查耳酮類的紅花黃色素（SY）占1/5～1/3[5-6]，是紅花的主要有效成分，有抗心肌缺血、擴張冠狀動脈、抑制血小板凝聚、促進血液循環(huán)、抗氧化、抗炎等藥理作用[7-9]。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia- lyase，PAL）將苯丙氨酸脫氨轉化成反式肉桂酸，該反應是紅花黃酮類生物合成途徑的起始反應，苯丙烷類合成代謝的關鍵酶。PAL 在植物發(fā)育過程中起作用，對苯基丙烷次生代謝產(chǎn)物進行調控，對多種環(huán)境刺激產(chǎn)生響應[10-13]。PAL 通常是由小的多基因家族編碼[12]，PAL基因家族常含有的2～6 個家族成員（PAL1、PAL2 和PAL3 等）在植物中的表達具有組織特異性[13]，其相對分子質量在220 000～340 000，是一種由4 個77 000～83 000 亞基構成的寡聚酶[14-15]。PAL受內(nèi)部鈍化因子、調節(jié)因子和末端產(chǎn)物的調控，是一種誘導酶，當植物在受到病原體攻擊、機械損傷、紫外線照射、鹽分脅迫、植物激素（乙烯等）和光等刺激后，快速在轉錄水平上誘導PAL 編碼基因的表達[16]。

利用真核或原核微生物研究一個簡單的次生代謝產(chǎn)物的生物合成，至少需轉入多個植物外源基因才能實現(xiàn)[17]。并且利用原核微生物表達植物蛋白酶，尚存在缺乏輔助因子、蛋白折疊錯誤、宿主膜的插入和產(chǎn)生包涵體等問題[18-19]。因此，與微生物相比，植物細胞含有次生代謝產(chǎn)物合成和儲存的全部遺傳信息。紅花植株的生長周期為1～2年，故在整株植物水平上進行遺傳操作較困難，而組織培養(yǎng)產(chǎn)生再生植株則容易存在生根困難和再生率低等問題[20-21]，這極大地限制了紅花功能基因研究和紅花黃酮生物合成研究的進程。未分化的植物愈傷組織在受控的液體培養(yǎng)基中進行不斷攪動或搖動，可產(chǎn)生懸浮細胞。懸浮細胞具有增殖迅速、遺傳背景清晰、分散性好、可體外操作且易控制[20-22]的優(yōu)點，成為研究植物次生代謝產(chǎn)物及合成生物學必不可少的工具，可以作為體外大量合成植物次生代謝產(chǎn)物的良好生物反應器[22]。

因此，建立轉基因紅花懸浮細胞遺傳體系，對進一步深入研究黃酮合成代謝調控具有重要的意義。目前，已有相關研究利用懸浮細胞，在基因和細胞水平上進行克隆表達，如利用煙草[23]、白樺[24]、雷公藤[25-27]、綠竹[28]、甘草[29]、蘋果[30]懸浮細胞，研究其功能基因在生長發(fā)育、次生代謝和環(huán)境適應中的作用[31]。但是，通過紅花懸浮細胞研究苯丙烷類次生代謝關鍵酶基因的相關研究，尚無報道。本研究在紅花基因組測序基礎上，對紅花PAL家族進行全基因組分析，并建立了紅花懸浮細胞遺傳轉化體系，成功構建了對紅花PAL4（CtPAL4）基因表達載體，并初步在懸浮細胞中進行表達，一方面，為研究紅花PAL基因的功能，探討其在紅花黃酮次生代謝途徑中的作用奠定基礎；另一方面，為紅花懸浮細胞在功能基因、次生代謝調控及生物反應器等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料

樣品經(jīng)筆者鑒定為紅花Carthamus tinctoriusL.吉紅一號，于吉林農(nóng)業(yè)大學生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程中心基地種植，于盛花期采集花瓣，錫箔紙包好液氮處理后，保存于-80 ℃冰箱備用。pCAMBIA 3301 植物表達載體由本實驗室保存。

1.2 試劑

RNA 提取試劑盒，購自北京百泰克生物技術有限公司；反轉錄酶，購自Clontech 公司；LA Taq 酶等購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；BglII、BstE II 等內(nèi)切酶，購自Thermo Scientific 公司；pEASY-T1 Simple Cloning Kit（CT111-01），購自北京全式金生物技術有限公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒，購自愛思進生物技術有限公司；T4 連接酶購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

MS 基礎培養(yǎng)基（蔗糖20 g/L、MS 粉4.33 g/L、肌醇0.1 g/L、有機營養(yǎng)液3.4 mg/L 和瓊脂粉8 g/L），有機營養(yǎng)液配方（甘氨酸0.4 g/L、煙酸0.1 g/L、鹽酸吡哆素0.1 g/L 和鹽酸硫酸素0.08 g/L）；愈傷誘導培養(yǎng)基（MS 基礎培養(yǎng)基、NAA 2 mg/L 和6-BA 0.5 mg/L）；繼代培養(yǎng)基（MS 基礎培養(yǎng)基、NAA 1 mg/L和6-BA 0.5 mg/L）；懸浮細胞液體培養(yǎng)基（不加瓊脂粉的MS基礎培養(yǎng)基、NAA 1 mg/L和6-BA 0.5 mg/L）；YEP 培養(yǎng)基（酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L 和氯化鈉5 g/L，如需固體YEP 則添加瓊脂粉8 g/L）；LB 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L 和酵母粉5 g/L）。

2 方法

2.1 紅花PAL 家族全基因組分析

從Pfam 數(shù)據(jù)庫下載PAL 蛋白保守結構域的隱馬爾科夫模型文件（PF00221），以PF00221 為探針，利用HMMER3.0 軟件在紅花基因組中檢索具有該結構域的基因。利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析，NCBI 的CDD（conserved domain database）數(shù)據(jù)庫對蛋白質序列的功能結構域進行分析預測。提取轉錄起始點上游2000～200 bp 序列，利用plantCARE 在線分析啟動子上游區(qū)域順式作用元件，并用TBtools 實現(xiàn)重要順式作用元件的可視化分析。利用CLSTAL X1.81 和MEGA 5.2 進行多重序列比對分析和聚類分析，構建紅花PAL 家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2.2 紅花總RNA 提取及cDNA 合成

紅花（吉紅一號）盛花期花瓣總RNA 提取使用RNA 提取試劑盒（BioTeke 公司），按說明書進行操作，然后用反轉錄酶合成cDNA 第1 鏈，反轉錄cDNA 作為CtPAL4基因克隆模板。

2.3 CtPAL4 基因的克隆

根據(jù)紅花基因組測序結果，獲得紅花PAL基因的多條候選序列，將候選序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫其他植物進行同源性比對，將同源性高的序列（CtPAL4）作為候選基因進行克隆，基因的特異性引物序列為5’-ATGGATCAATACATGAGCAATGTTATGAAGA- AATAGGAAGTGG-3’。

以紅花花瓣cDNA 為模板進行編碼區(qū)序列的擴增，首先進行溫度梯度PCR，獲得最佳退火溫度。PCR反應體系：cDNA 1 μL，dNTP Mixture 8 μL，10×LA Buffer 5 μL，上游引物CtPAL4f（10 μmol/L） 1 μL，下游引物CtPAL4r（10 μmol/L） 1 μL，LA Taq 0.5 μL，水33.5 μL，總體積50 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。凝膠電泳檢驗是否獲得目的條帶。擴增產(chǎn)物凝膠回收后連接T 載體進行測序。

2.4 CtPAL4 基因的生物信息學分析

利用WOLF PSORT 進行亞細胞定位分析，分別利用EXPASY-SOPMA 軟件和EXPASY-phyre2 進行蛋白質二級結構和三級結構分析。利用DNAMAN 軟件進行多序列比對分析，用Conserved Domains Search（InterProScan）預測蛋白質序列的功能結構域，利用CLSTAL X1.81 進行系統(tǒng)進化樹分析。利用Tmpred 預測蛋白的跨膜結構，利用ProtFun202 進行功能預測， ProtParam 軟件（http://web.expasy.org/）分析編碼蛋白的氨基酸序列的組成、相對分子質量和等電點等理化性質。

2.5 CtPAL4 基因植物表達載體的構建

以pCAMBIA 3301（圖1）作為植物表達載體骨架，將測序正確的CtPAL4兩端分別引入酶切位點BglII 和BstE II，替換載體上的β-葡聚糖苷酶報告基因（GUS），構建植物表達載體。以獲得的CtPAL4基因T 載體為模板，進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物凝膠回收后連接T 載體進行測序。對連有酶切位點的CtPAL4基因的T 載體和pCAMBIA 3301 載體分別進行雙酶切，建立200 μL 酶切體系，經(jīng)過4 h 酶切后，獲得的酶切產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒切膠回收CtPAL4目的基因片段和pCAMBIA 3301 載體。將獲得的CtPAL4目的基因片段和pCAMBIA 3301 載體用T4 DNA Ligase 酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌Trans1-T1 感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)。次日，挑取白斑至10 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，200 r/min，37 ℃，培養(yǎng)8 h。提取質粒進行PCR 和酶切鑒定，酶切鑒定正確的菌液進行測序。

圖1 pCAMBIA3301 表達載體結構示意圖Fig.1 Structure of pCAMBIA3301 expression vector

2.6 工程農(nóng)桿菌的轉化

驗證正確的質粒1 μL，加入到EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，冰浴30 min。液氮冷凍5 min，37 ℃水浴，熱擊5 min。在離心管中加入1 mL 不加抗生素的YEP 液體培養(yǎng)基，混勻后放于搖床中，28 ℃，200 r/min 振蕩4 h。5000 r/min 離心6 min。離心后加入200 mL YEP 液體培養(yǎng)基進行重懸。取重懸后的菌體涂在含有10 mg/L 利福平的YEP 固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。待長出菌落后，挑取單菌落，于10 mg/L 利福平的YEP 液體培養(yǎng)基的試管中， 過夜培養(yǎng)后進行菌液PCR 驗證，將驗證正確的菌液加入甘油，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7 紅花懸浮細胞遺傳體系的建立

利用實驗室已建立的體系獲得紅花懸浮細胞[19]，將紅花種子接種到MS 基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)出無菌苗；無菌苗子葉外植體接種到愈傷誘導培養(yǎng)基中，進行誘導；誘導出的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 代。挑選質地疏松、不透明且淡黃色的愈傷組織[32]用于遺傳轉化。按照設計的實驗組別進行遺傳轉化實驗，每個組別進行3 次平行實驗。三角瓶開口放一漏斗，漏斗上覆蓋空氣濾膜。三角瓶放于真空干燥罐內(nèi)真空處理，調節(jié)空氣壓力至10、20、30 kPa，分別在15、10、7 min 內(nèi)緩慢地釋放壓力，完成侵染過程。過濾除去液體培養(yǎng)基，濾紙吸收多余工程農(nóng)桿菌，洗菌后轉移至選擇培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3 或4 天。使用羧芐（0、75 mg/L），頭孢（100 mg/L）和草甘膦（0.50、0.75、1.00、1.25 mg/L）對遺傳轉化后的愈傷組織進行壓力篩選，每個組別進行3 次平行實驗。

對獲得的愈傷組織進行GUS組織化學分析[34]。利用含有GUS基因pCAMBIA3301 的轉化農(nóng)桿菌，侵染紅花愈傷組織，在轉化后15 d，進行GUS 染色，將紅花愈傷組織浸泡在含有1 mmol/L X-Gluc [溶于0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和30% Triton X-100] 的GUS 染色液中，37 ℃暗培養(yǎng)過夜。分析前，用95%乙醇脫色除去葉綠素。在Olympus顯微鏡下，觀察轉基因愈傷組織中GUS基因瞬間表達產(chǎn)物（β-葡聚糖苷酶）對底物的水解情況。

2.8 轉CtPAL4 基因紅花懸浮細胞的PCR 鑒定

選取質地疏松且分散性好的胚性愈傷組織接種到懸浮細胞液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)，避光搖床轉速為100 r/min，獲得紅花懸浮細胞。吸取連續(xù)繼代3代的轉基因紅花懸浮細胞，經(jīng)孔徑100 目鎳網(wǎng)過濾，過濾物0.5 g 提取基因組，用于PCR 擴增。PCR 反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物。

3 結果與分析

3.1 紅花PAL 家族全基因組分析

在紅花基因組測序結果中，共注釋到紅花PAL家族6 個基因。利用NCBI 的CDD 數(shù)據(jù)庫預測蛋白質序列的功能結構域。結果顯示，5 個（CtPAL1～5）紅花PAL 基因均具有PAL 家族的典型結構域（MIO結構域）及活性位點（圖2-A），且含有PAL 酶家族的保守序列（GTITASGDLVPLSYIAG）。使用plantCARE 在線分析順式作用元件，并用TBtools 對紅花PAL家族基因啟動子中選定的9個重要順式作用元件進行可視化分析（圖2-B）。啟動子區(qū)域包含多個典型啟動子核心調控元件、激素響應元件和植物逆境脅迫響應元件。9 個順式作用元件分別為茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-Motif）、防御及脅迫響應元件（TC-rich）、分生組織表達元件（CAT-box）、光響應元件（G-box）、光響應元件（MRE）、MYBHv1 結合位點（CCAAT-box）、MBSI（類黃酮合成相關的MYB轉錄因子結合位點）、AAGAA-motif。

利用DNAMAN 軟件將6 個紅花PAL家族基因與大麥、擬南芥和水稻等的基因進行同源性比較分析，并利用軟件MEGA 5.2 鄰接法聚類分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結果表明：80 個PAL序列明顯聚成5 個分支，6 個紅花PAL 家族基因單獨聚在一個進化枝，同時與擬南芥（AT3G53260.1，AT2G37040.1）聚集在相同的分支，說明紅花與擬南芥PAL基因家族的親緣關系較近。其中，CtPAL4單獨聚在一個分支上，說明在紅花植株中CtPAL4可能與其他PAL基因行使不同的功能。因此，本研究將CtPAL4基因作為后續(xù)研究對象。

圖3 紅花PAL 家族基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Carthami Flos PAL family genes

3.2 紅花總RNA 的提取

選擇紅花花瓣作為材料，提取總RNA。提取后的RNA 使用Nanodrop2000 進行RNA 濃度檢測，其濃度為1368 μg/μL，A260/A280的比值為1.92，A260/230的比值為1.94。由此可見提取的RNA 樣品純度較高。瓊脂糖凝膠電泳結果中28 S、18 S、5 S條帶清晰可見，無明顯拖尾現(xiàn)象（圖4），說明所獲得RNA 樣品完整性較好。綜上，所提取的紅花總RNA 純度較高、完整性較好，可用于反轉錄獲得cDNA 實驗。

圖4 紅花花瓣 (A) 及RNA 提取 (B) 電泳結果Fig.4 Total RNA agarose gel electrophoresis and petals from Carthami Flos

3.3 CtPAL4 基因的克隆

根據(jù)基因組中獲得的CtPAL4基因編碼區(qū)序列，以反轉錄的紅花花瓣cDNA 為模板，首先進行溫度梯度PCR 驗證（圖5-A），利用CtPAL4f 和CtPAL4r特異性引物進行PCR 擴增，結果顯示，退火溫度58 ℃時，在2000～4000 bp 位置擴增出目的片段，條帶較亮且特異，說明設計的該對引物特異性良好。將目的基因片段膠回收后與T1 連接并轉化大腸桿菌，菌液PCR 電泳驗證（圖5-B）有目的條帶出現(xiàn)，對含有目的條帶的大腸桿菌提取質粒，用BamHI和EcroI酶過夜雙酶切。產(chǎn)物電泳檢測（圖5-C），將鑒定正確的菌液送蘇州金唯智公司測序，測序結果獲得2124 bp 的目的序列，測序結果與原序列吻合，因此將其命名為CtPAL4。

圖5 CtPAL4 基因編碼區(qū)克隆Fig.5 Cloning of coding sequence for CtPAL4 gene

3.4 CtPAL4 基因的生物信息學分析

將測序正確的CtPAL4基因序列進行生物信息學分析。序列分析表明，CtPAL4基因的開放閱讀框（ORF）為2124 bp，編碼707 個氨基酸（圖6-A），相對分子質量為76 820，蛋白的三維結構如圖6-B所示，與苯丙氨酸解氨酶X 射線蛋白質晶體結構類似。用Conserved Domains Search（InterProScan）預測蛋白質序列的功能結構域結果顯示，CtPAL4基因具有典型的苯丙氨酸解氨酶基因的功能結構域及活性位點（圖6-C）?；诘鞍踪|數(shù)據(jù)庫，應用WOLF PSORT 在線分析軟件，對CtPAL4基因編碼蛋白進行亞細胞定位分析，推測其在細胞中的位置，結果顯示，其可能定位在葉綠體和細胞質中，與PAL 定位于細胞質和一些細胞器（葉綠體、線粒體、過氧化酶體）相吻合。

圖6 CtPAL4 基因編碼氨基酸組成及蛋白結構分析Fig.6 Amino acids and protein structure of CtPAL4 gene

3.5 CtPAL4 基因的系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN 軟件將CtPAL4基因與其他物種的基因進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析。利用clustalW1.83軟件進行多重序列比對、聚類分析，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。 結果顯示，CtPAL4基因與擬南芥（AY303130.1）的PAL基因聚在相同的分支，說明從進化上看，紅花CtPAL4和擬南芥PAL 基因親緣關系最近（圖7）。

圖7 CtPAL4 基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.7 Analysis of evolutionary of CtPAL4 gene and others

3.6 CtPAL4 基因的植物表達載體構建

將前期驗證成功的CtPAL4基因，在其引物兩端引入BglII 和BstE II，進行PCR 擴增，獲得帶有含BglII 和BstE II 雙酶切位點的CtPAL4基因，將其連接T 載體后命名為pEASY-T1-CtPAL4。將植物表達載體 pCAMBIA3301 和pEASY-T1-CtPAL4分別用BglII 和BstE II 進行雙酶切，目的片段與酶切后的pCAMBIA3301 載體用T4-DNA 連接酶連接后，得到植物表達載體pCAMBIA3301-CtPAL4。將構建好的植物表達載體轉化大腸桿菌DH5α，對重組陽性質粒進行菌液PCR 驗證（圖8-A）和雙酶切驗證（圖8-B），都獲得預期大小為2124 bp 的目的片段，測序結果與預期相符，證明植物表達載體構建成功。將酶切測序正確的植物表達載體pCAMBIA3301-CtPAL4質粒，利用凍融法轉化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，轉化后涂板，對挑取的9 個單菌落進行農(nóng)桿菌菌液PCR 鑒定（圖8-C），其中有2條非常亮的目的條帶出現(xiàn)，說明農(nóng)桿菌轉化成功，可以用于下一步的遺傳轉化。

圖8 CtPAL4 基因植物表達載體構建Fig.8 Construction of plant expression vector of CtPAL4

3.7 紅花懸浮細胞遺傳體系的建立

對紅花種子暗培養(yǎng)而成的無菌苗子葉進行愈傷誘導和繼代培養(yǎng)，獲得質地疏松、不透明且黃綠色的愈傷組織，作為遺傳轉化受體。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)、pBaster 篩選和繼代培養(yǎng)后獲得轉基因紅花愈傷組織。獲得的愈傷組織經(jīng)過液體培養(yǎng)，形成均一的轉基因紅花懸浮細胞。

結果表明，當真空壓力超過20 kPa 時，愈傷組織細胞容易發(fā)生破碎；當重懸液A600高于0.5 時，農(nóng)桿菌難以被抑制，愈傷組織生長緩慢易褐化；共培養(yǎng)時間可延長至4 d。實驗得出較優(yōu)的遺傳轉化條件組合：重懸液A600＝0.5、10 kPa、侵染15 min 并共培養(yǎng)4 d。

結果表明，在75 mg/L 羧芐、100 mg/L 頭孢和1.0 mg/L 草甘膦壓力下，起到了一定的篩選作用。未經(jīng)轉化的愈傷組織幾乎全部褐化死亡，而遺傳轉化的愈傷組織因為具有篩選標記基因可以正常生長且長勢良好。

對轉GUS基因愈傷組織進行組織化學染色，如圖9 所示，顯微鏡下觀察GUS轉基因細胞為藍色，而非GUS轉基因則為棕綠色，說明外源基因已經(jīng)成功轉入到愈傷組織中。

圖9 轉基因愈傷組織GUS 染色驗證Fig.9 GUS staining of transgenic callus

同時，將愈傷組織置于液體培養(yǎng)基中，避光搖床25 ℃、100 r/min 培養(yǎng)7 d，濾出愈傷組織，濾紙吸干表面水分。將細胞培養(yǎng)物置于60 ℃烘箱中烘3 h，計算細胞增長率為190.7%。

3.8 轉CtPAL4 基因懸浮細胞的分子鑒定

經(jīng)過壓力篩選去除掉未經(jīng)轉化的愈傷組織，遺傳轉化的愈傷組織形成的轉CtPAL4基因懸浮細胞，繼代培養(yǎng)3 次后，提取轉基因愈傷組織的基因組DNA，利用PAL 特異引物CtPAL4r 和CtPAL4f 進行PCR 鑒定。電泳結果如圖10 所示，目的基因條帶與CtPAL4基因大小一致，為2124 bp。因此，說明CtPAL4基因初步在紅花懸浮細胞中實現(xiàn)過表達。

圖10 轉CtPAL4 基因懸浮細胞的分子鑒定Fig.10 Molecular identification of transgenic callus

4 討論

PAL（EC 4.3.1.5）通常是由小的多基因家族編碼[12]，在不同的植物物種中，PAL 基因家族的數(shù)量差異很大，從2 個到12 個不等，甚至達到40～50個[34]。在大多數(shù)高等植物中，PAL 是由2～6 個基因家族構成的小基因家族編碼的[35]。通過對紅花PAL基因家族進行生物信息學分析，在紅花基因組中共檢索到6 個含有PAL 特有結構域的紅花PAL家族基因，說明紅花有6 個PAL基因家族成員，與其他大多數(shù)植物PAL基因家族成員個數(shù)相似，基本不含冗雜和未被利用的PAL。PAL 為同源四聚體，每個單體含有1 個MIO 結構域。MIO 結構域是PAL酶催化的輔因子，MIO 結構域含有PAL 酶家族的保守序列（GTITASGDLVPLSYIAG）和三聯(lián)體活性中心（Ala-Ser-Gly）[36]。MIO 結構域三聯(lián)體活性中心作為輔酶增強PAL 活性，通過攻擊苯丙氨酸的芳香環(huán)，而增加苯丙氨酸的親電性，來實現(xiàn)催化苯丙氨酸生成肉桂酸[37]，紅花中的CtPAL1～5基因家族成員均含有MIO 結構域，均可以催化苯丙氨酸生成肉桂酸。CtPAL6不具有MIO 結構域，在紅花中可能行使不同的生理功能，也可能屬于冗雜或未被利用的PAL。

農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化已經(jīng)被廣泛應用于多種植物物種，目前，番茄、甜椒、馬鈴薯、油桐、煙草和橡膠樹等多種植物的遺傳轉化日趨完善[38-40]。但是，通過農(nóng)桿菌介導的紅花愈傷組織CtPAL4基因遺傳轉化研究尚少，尚未建立一個有效完整的方案。本研究應用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化，成功將紅花黃酮代謝中關鍵酶PAL基因轉化入紅花愈傷組織，并形成紅花懸浮細胞。紅花種子暗培養(yǎng)而成的無菌苗子葉外植體，誘導形成的愈傷組織對農(nóng)桿菌侵染有敏感性，且耐侵染、抑菌性強、恢復力強，符合作為遺傳轉化的受體條件[41]，紅花種子經(jīng)過5 d 的種子萌發(fā)、12 d 的植物激素（萘乙酸和6-芐基氨基喋呤）誘導愈傷和愈傷繼代培養(yǎng)，獲得質地疏松、不透明且黃綠色的愈傷組織，可以作為根瘤農(nóng)桿菌遺傳轉化的受體。農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化需要經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、抑菌培養(yǎng)、pBaster篩選和繼代培養(yǎng)，才能獲得轉基因紅花愈傷組織。目前的研究結果表明，農(nóng)桿菌介導紅花遺傳轉化效率取決于紅花的基因型、苗齡、共培養(yǎng)時間、細菌細胞密度、AS 濃度和外植體類型等多種因素[33]。本實驗建立的遺傳轉化方案較優(yōu)，轉化效率較高。

PAL 是目前研究最廣泛的植物次生代謝酶之一。PAL 因其在植物發(fā)育中的作用，對植物類苯基丙烷次生代謝產(chǎn)物的調控，對多種環(huán)境刺激的響應而被廣泛研究。PAL 催化的轉氨反應，是紅花黃酮類生物合成途徑的起始反應，其表達水平與木脂素、黃酮類、香豆素和植物抗毒素的合成和積累密切相關[42-44]。PAL 又是一種誘導酶，當植物在受到病原體攻擊、機械損傷、紫外線照射、鹽分脅迫、植物激素（乙烯等）和光等刺激后，快速在轉錄水平上誘導PAL 編碼基因的表達[12-14,16]。本研究通過生物信息學分析紅花PAL 基因家族啟動子上游順式作用元件，發(fā)現(xiàn)紅花具有茉莉酸甲酯響應元件、防御及脅迫響應元件、光響應元件和類黃酮合成相關的 MYB 轉錄因子結合位點等順式作用元件。可見當紅花受到環(huán)境刺激，相應的順式作用元件在轉錄水平進行調控[45]，從而影響PAL 的轉錄表達。

轉基因懸浮細胞培養(yǎng)被應用于細胞和分子生物學的基礎研究（如功能基因的研究）和合成生物學方面（如藥用蛋白的生產(chǎn)）。在這2 種情況下，外源基因或內(nèi)源基因的轉移和穩(wěn)定整合都是必需的技術[46]。目前，王立勇等[19]實現(xiàn)人源CD20 片段抗體在紅花懸浮細胞中的外源基因表達；劉金娜等[47]實現(xiàn)番茄Bax inhibitor-1 基因在煙草懸浮細胞中的外源基因表達；在研究雷公藤、綠竹、甘草等植物生長代謝相關基因功能時，懸浮細胞同源基因的轉化與表達也得以實現(xiàn)[25-26,28-29,46]。本研究轉CtPAL4基因紅花懸浮細胞在經(jīng)過3 次繼代培養(yǎng)后，PCR 鑒定仍有目的基因出現(xiàn)，說明CtPAL4基因已經(jīng)初步在紅花懸浮細胞中實現(xiàn)過表達，為后續(xù)利用轉基因紅花懸浮細胞鑒定外源基因提供理論依據(jù)。為研究CtPAL4等合成代謝關鍵酶基因在次生代謝產(chǎn)物中的功能和作用、紅花懸浮細胞產(chǎn)業(yè)化生物合成黃酮類次生代謝產(chǎn)物，奠定理論和實踐基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突