防風不同提取部位的燥性差異及其對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠滑膜水通道蛋白的影響

梁瑞峰 ，李兵杰 ，葛文靜，王慧森，劉 明，崔偉鋒，張雪俠，王 軍，李更生*

1.河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州 450004

2.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南 鄭州 450046

風藥是具有祛風勝濕、升發(fā)清陽等作用，用于風邪致病的一類藥物，屬于法象藥理的稱謂。風藥氣輕味薄，性味多辛香走竄，因其溫燥之性而易于耗氣傷陰，產(chǎn)生口渴多飲、大便干結、口鼻干燥等燥性癥狀。燥性是對中藥祛除濕邪作用的概括，是中藥的固有性能和特定效用表征，燥能除濕是中藥發(fā)揮治療作用的性質，過燥傷陰則是藥物產(chǎn)生不良反應的因素。防風為風藥的典型代表，具有祛風解表、勝濕止痛、升清燥濕的功效，其性平和，質松而潤，辛甘發(fā)散而無燥烈傷陰之弊，被譽為“風藥中之潤劑”。目前已有文獻在傳統(tǒng)理論方面對防風“風藥中之潤劑”的特性進行了研究[1]，但對其現(xiàn)代科學內涵的詮釋則未見報道。

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是特異性跨膜轉運水的蛋白家族，至今已發(fā)現(xiàn)有13 種亞型AQP，表達于不同組織器官中，參與水的吸收與轉運，與機體津液的生成、輸布、排泄關系密切[2]。AQP 受多種機制調節(jié)，其表達和功能異常可導致水液代謝紊亂[3]。中醫(yī)認為，濕邪致病從其性狀上可分為有形可見的濕病如水腫和潛在不可見的濕病如風濕痹痛，但均與津液失衡有關，AQP 可能是津液病證發(fā)生的生物學基礎[4]?；凇帮L能勝濕，過燥傷陰”的中醫(yī)理論，AQP 可能是風藥治病與致病的靶點。本實驗通過正常大鼠并以飲水量、尿量、大便含水量、 血清環(huán)磷酸腺苷（ cyclic adenosine monophosphate，cAMP）含量、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）含量、血液流變學和不同組織中不同亞型的AQP 表達量等為指標，考察防風不同提取部位的燥性效應；通過膠原誘導性關節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型，選取關節(jié)腫脹度、炎癥因子及關節(jié)滑膜AQP-1為評價指標，探究防風不同提取部位勝濕止痛的作用機制，以期為闡明防風“風藥中之潤劑”的特性奠定基礎，也為風藥的合理運用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠，體質量（200±10）g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號SCXK（豫）2015-0004，飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，標準飼料喂養(yǎng)，自由飲食飲水。本實驗經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會批準，批準號HNZYYYJ2019-0039。

1.2 藥物與試劑

防風、羌活購自亳州市張仲景中藥飲片有限責任公司，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所王慧森副研究員鑒定， 分別為傘形科植物防風Saposhnikovia di varicata(Turcz.) Schischk.的干燥根和傘形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang.的干燥根及根莖，均符合《中國藥典》2020年版項下規(guī)定。

弗氏完全佐劑、牛源II 型膠原，美國Sigma 公司；cAMP、cGMP 試劑盒，北京華英生物技術研究所；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；AQP-1、AQP-2、AQP-4、AQP-5、AQP-9、β-actin 抗體和羊抗兔IgG 二抗，北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 儀器

Synergy NEO 全功能酶標儀，美國Bio-Tek 公司；電泳儀、轉印槽，北京六一生物科技有限公司；FluorChem R 凝膠成像分析儀，美國ProteinSimple公司；PV-200 足趾容積測量儀，成都泰盟軟件有限公司；LBY-N6C 血液流變儀，北京普利生儀器有限公司；RM2245 型切片機，德國Leica 公司；CX31顯微鏡，日本Olympus 公司。

2 方法

2.1 防風不同提取部位及羌活總提取物的制備

2.1.1 防風總提取物 防風粉碎過40 目篩，稱取500 g 藥材粉末，加入8 倍量95%乙醇加熱回流提取2 次，每次1.5 h，將2 次濾液合并，回收溶劑至無醇味，得乙醇提取物。剩余殘渣用6 倍量蒸餾水煎煮2 次，每次1.0 h，濾過合并，濃縮干燥后得水提取物。將乙醇提取物與水提取物混合，作為防風總提取物，高效液相色譜法分析升麻素苷質量分數(shù)為1.07%。取一部分用于分離制備不同極性部位，其余實驗時用2%聚山梨酯80 配制成含生藥量2.5 g/mL 的溶液。

2.1.2 防風不同極性提取部位 取防風總提取物浸膏用適量蒸餾水制成混懸液，然后依次用等體積的石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取3 次，合并各部分萃取液，減壓回收溶劑分別得石油醚、醋酸乙醋、正丁醇及萃余水部位。實驗時用2%聚山梨酯80 配制成含生藥量2.5 g/mL 的溶液。

2.1.3 羌活總提取物 按照“2.1.1”項防風總提取物的制備方法制備羌活總提取物，用2%聚山梨酯80 配制成含生藥量2.5 g/mL 的溶液供實驗用。

2.2 防風不同提取部位的燥性實驗

2.2.1 分組及給藥 雄性SD 大鼠適應性飼養(yǎng)3 d后，根據(jù)體質量隨機分為7 組：對照組、羌活組（5.0 g/kg）、防風石油醚部位組、防風醋酸乙酯部位組、防風正丁醇部位組、防風水部位組和防風總提取物組（按等效劑量5 倍確定防風不同部位給藥劑量，均按生藥量為5.0 g/kg），每組10 只。對照組ig 給予生理鹽水，其余組ig 給予相應藥物，每天給藥1次，連續(xù)28 d。

2.2.2 飲水量、尿量和糞便含水量 于給藥第24天開始將大鼠放入代謝籠內，每日定時定量添加飲水，記錄大鼠每日的飲水量和排尿量，連續(xù)記錄3 d，取平均值。第27 天收集12 h 的新鮮大便，稱濕質量，然后置于110 ℃烘箱中干燥2 h，稱干質量，計算糞便含水量。

2.2.3 血清中cAMP、cGMP 含量 末次給藥后大鼠禁食12 h，ip 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3000 r/min 離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測大鼠血清cAMP、cGMP 含量，并計算cAMP/cGMP 值。

2.2.4 血液流變學指標 腹主動脈取血2 mL 置于肝素鈉抗凝的采血管中，吸取全血加入血液流變儀的樣品槽中，測定低切（1 s-1）、中切（5、50 s-1）和高切（200 s-1）下的全血黏度。

2.2.5 AQP 表達檢測 取血后分離大鼠腎、頜下腺和結腸，RIPA 裂解液提取組織蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，變性后取等量蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE 分離后轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，棄去封閉液，漂洗3 次后分別加AQP-2（1∶800）、AQP-5（1∶600）、AQP-4（1∶600）、AQP-9（1∶600）及β-actin 一抗（1∶1000），4 ℃過夜，漂洗3 次，滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL 顯色液曝光，拍照，Image J 軟件對蛋白條帶進行分析，以目的條帶/ β-actin（內參）灰度值分析腎中AQP-2、頜下腺中AQP-5、結腸中AQP-4 及AQP-9 的蛋白表達。

2.3 防風不同提取部位對關節(jié)炎大鼠的影響

2.3.1 造模、分組及給藥 雄性SD 大鼠適應性飼養(yǎng)3 d 后根據(jù)體質量隨機分為8 組：對照組、模型組、羌活組（5.0 g/kg）、防風石油醚部位組、防風醋酸乙酯部位組、防風正丁醇部位組、防風水部位組和防風總提取物組（按等效劑量5 倍確定防風不同部位給藥劑量，均按生藥量為5.0 g/kg），每組10只。將牛II 型膠原（type II collagen，CII）溶于0.1 mol/L 醋酸中配制成質量濃度為2.0 g/L 的溶液，混勻后4 ℃過夜，次日與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，制成含CII 1 g/L 的乳化劑。除對照組外，其余各組大鼠于背部、尾根部、右后足底多點共注射乳化劑0.1 mL，第8 天以0.1 mL 同種乳劑尾根部注射加強免疫1 次，建立CIA 大鼠模型[5]，對照組注射生理鹽水。各給藥組于造模當天起分別ig 給予相應藥物，對照組和模型組ig 給予等體積的蒸餾水，1 次/d，連續(xù)28 d。

2.3.2 一般情況 每天觀察動物精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤、活動等情況并記錄。

2.3.3 大鼠足跖腫脹度 分別于造模前及第7、14、21、28 天用足趾容積測量儀測量大鼠左、右后足容積，以大鼠造模前后的足趾容積差值為足跖腫脹度。右后足為原發(fā)性病變側，左后足為繼發(fā)性病變側。

2.3.4 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和PGE2含量 末次給藥24 h 后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心分離血清，采用ELISA 試劑盒檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和PGE2的含量。

2.3.5 踝關節(jié)組織形態(tài)學觀察 分離大鼠右后踝關節(jié)，用4%的多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫鈣，乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包理，切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察病理組織學變化。

2.3.6 滑膜組織中AQP-1 的表達 取大鼠右后膝關節(jié)滑膜組織，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取組織總蛋白，BCA 法定量蛋白濃度，變性后經(jīng)15% SDS-PAGE 分離后轉移至PVDF 膜，加入5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，棄去封閉液，漂洗后加入AQP-1（1∶600）及β-actin 一抗（1∶1000），4 ℃過夜，漂洗3 次，滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL 顯色液曝光拍照，以目的條帶/β-actin 灰度值表示蛋白相對表達量。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件對結果進行單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。

3 結果

3.1 對大鼠飲水量、尿量和糞便含水量的影響

與對照組比較，羌活組、防風石油醚部位組大鼠經(jīng)連續(xù)給藥28 d 后，飲水量、尿量明顯增加，糞便含水量顯著降低（P＜0.05、0.01）；其他給藥組大鼠的飲水量、尿量和糞便含水量與對照組相比無顯著變化。見表1。

3.2 對大鼠cAMP、cGMP 含量的影響

與對照組比較，羌活組、防風石油醚部位組大鼠血清cAMP 含量，cAMP/cGMP 均顯著升高（P＜0.05、0.01），其他組大鼠cAMP 含量，cAMP/ cGMP 無統(tǒng)計學差異；各組大鼠cGMP 含量變化不明顯。結果見表2。

3.3 對大鼠血液流變學的影響

與對照組比較，羌活組大鼠1、5、50、200 s-1切變率下的全血黏度明顯增加（P＜0.05、0.01），防風石油醚部位組大鼠1、5、50 s-1切變率下的全血黏度升高（P＜0.05、0.01），其他組大鼠的血漿黏度無明顯變化。結果見表3。

表1 防風不同提取部位對大鼠飲水量、尿量和糞便含水量的影響 ( ± s , n=10)Table 1 Effect of different extracts parts of S.divaricata on water intake, urine volume, and fecal water content in rats (± s , n=10)

表1 防風不同提取部位對大鼠飲水量、尿量和糞便含水量的影響 ( ± s , n=10)Table 1 Effect of different extracts parts of S.divaricata on water intake, urine volume, and fecal water content in rats (± s , n=10)

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，表2～4 同*P＜ 0.05 **P＜ 0.01 vs control group, same as tables 2—4

組別 劑量/(g·kg-1) 飲水量/g 尿量/g 糞便含水量/% 對照 — 41.36±7.39 16.83±6.68 46.83±2.11 羌活 5.0 66.58±12.27** 32.80±11.44** 43.37±1.72** 防風石油醚部位 5.0 60.35±11.46** 26.72±10.35* 44.06±1.85** 防風醋酸乙酯部位 5.0 48.69±9.71 20.03±7.53 45.69±2.35 防風正丁醇部位 5.0 45.36±9.13 18.95±7.82 46.17±2.27 防風水部位 5.0 40.10±8.07 16.10±6.81 47.75±2.32 防風總提取物 5.0 42.86±8.45 17.48±7.37 46.61±2.23

表2 防風不同提取部位對大鼠cAMP、cGMP 含量的影響 ( ± s , n=10)Table 2 Effect of different extracts parts of S.divaricata on content of cAMP and cGMP in rats (± s , n=10)

表2 防風不同提取部位對大鼠cAMP、cGMP 含量的影響 ( ± s , n=10)Table 2 Effect of different extracts parts of S.divaricata on content of cAMP and cGMP in rats (± s , n=10)

組別 劑量/(g·kg-1) cAMP/(nmol·L-1) cGMP/(nmol·L-1) cAMP/cGMP 對照 — 22.49±3.25 * *4.43±0.91 5.19±1.32 **羌活 5.0 34.73±5.06 4.28±0.83 8.36±1.76 防風石油醚部位 5.0 31.04±4.87 ** 4.57±0.98 6.93±1.53 * 防風醋酸乙酯部位 5.0 25.61±3.70 4.51±1.04 5.82±1.49 防風正丁醇部位 5.0 23.82±3.53 4.23±0.67 5.74±1.53 防風水部位 5.0 21.30±3.29 4.38±0.79 4.94±1.26 防風總提取物 5.0 23.07±3.61 4.48±0.84 5.33±1.38

表3 防風不同提取部位對大鼠全血黏度的影響 (± s , n=10)Table 3 Effect of different extracts parts of S.divaricata on blood viscosity of rats (± s , n=10)

表3 防風不同提取部位對大鼠全血黏度的影響 (± s , n=10)Table 3 Effect of different extracts parts of S.divaricata on blood viscosity of rats (± s , n=10)

別 劑量/(g·kg-1) 1 s-1 5 s-全1 血黏度/(mPa·s)5 0 s-1 200 s-1 組對照 — 26.58±2.09 9.27±0.61 6.97±0.66 3.87±0.56 羌活 5.0 32.47±3.81** 12.66±0.93** 8.48±0.96** 4.61±0.82* 防風石油醚部位 5.0 30.69±3.72** 11.83±1.02** 7.82±1.01* 4.39±0.77 防風醋酸乙酯部位 5.0 27.72±2.82 9.86±0.80 7.16±0.73 4.06±0.60 防風正丁醇部位 5.0 27.13±2.41 9.34±0.76 6.95±0.68 4.15±0.63 防風水部位 5.0 26.10±2.67 8.93±0.87 6.64±0.66 4.04±0.55 防風總提取物 5.0 26.91±2.36 9.49±0.73 7.02±0.61 3.94±0.58

3.4 對大鼠AQP 表達的影響

由圖1 和表4 結果顯示，與對照組比較，羌活、防風石油醚部位組大鼠腎組織中AQP-2，頜下腺組織中AQP-5 和結腸中AQP-9 表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。防風醋酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位及總提取物對正常大鼠的AQP-2、5、4、9表達均無明顯影響。

圖1 防風不同提取部位對大鼠AQP 表達的影響Fig.1 Effect of different extracts parts of S.divaricata on expression of AQP in rats

3.5 關節(jié)炎大鼠的一般情況

對照組大鼠狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，動作自如，反應靈敏，大便正常。CIA 模型組大鼠經(jīng)膠原乳化劑致敏、加強免疫后，可見精神倦怠，活動受限，被毛失去光澤，關節(jié)紅腫且表面皮膚發(fā)亮充血，足墊增厚，大便稀溏；防風正丁醇部位組、總提取物組和羌活組大鼠較模型組關節(jié)紅腫明顯減輕，活動增加；防風石油醚部位組整體情況較防風總提物組差，但優(yōu)于模型組；防風醋酸乙酯部位組和水部位組大鼠情況較模型組未見明顯改善。

表4 防風不同提取部位對大鼠AQP 表達的影響 ( ± s , n=10)Table 4 Effect of different extracts parts of S.divaricata on expression of AQP in rats (± s , n=10)

表4 防風不同提取部位對大鼠AQP 表達的影響 ( ± s , n=10)Table 4 Effect of different extracts parts of S.divaricata on expression of AQP in rats (± s , n=10)

組別 劑量/(g·kg-1) AQP-2 AQP-蛋5 白 相對表達量A QP-4對照 — 0.46±0.06 0.36±0.06 0.59±0.羌活 5.0 0.32±0.05** 0.23±0.05** 0.64±0.防風石油醚部位 5.0 0.37±0.07* 0.26±0.06** 0.54±0.防風醋酸乙酯部位 5.0 0.44±0.08 0.33±0.07 0.58±0. AQP-9 11 0.28±0.06 14 0.18±0.06** 13 0.22±0.05* 15 0.31±0.07 防風正丁醇部位 5.0 0.45±0.09 0.37±0.10 0.56±0.12 0.33±0.06 防風水部位 5.0 0.49±0.08 0.39±0.07 0.60±0.16 0.30±0.05 防風總提取物 5.0 0.47±0.10 0.40±0.08 0.58±0.13 0.31±0.07 ?

3.6 對關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹度的影響

與對照組比較，造模7 d 時模型組大鼠原發(fā)側（右后）足腫脹明顯（P＜0.01），造模14 d 時大鼠右后足腫脹度達到高峰（P＜0.01），表明模型建立成功。與模型組相比，羌活組、防風總提取物組于給藥14 d 時最先有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），且大鼠原發(fā)側足腫脹度持續(xù)顯著下降（P＜0.01）；防風正丁醇部位組大鼠在21 d 時原發(fā)側足腫脹明顯降低（P＜0.05），28 d 時具有明顯差異（P＜0.01）；石油醚部位組大鼠在給藥28 d后原發(fā)側足腫脹明顯降低（P＜0.05）；醋酸乙酯部位組及水部位組大鼠原發(fā)側足腫脹無顯著性差異。結果見表5。

與對照組比較，造模7 d 時模型組大鼠繼發(fā)側（左后）足腫脹度增加（P＜0.01），21 d 時達到高峰（P＜0.01），表明病變累及其他關節(jié)。與模型組相比，羌活組和防風總提取物組大鼠于14 d時繼發(fā)側足腫脹度減小（P＜0.05），且隨著給藥時間延長持續(xù)顯著下降（P＜0.01）；防風正丁醇部位組大鼠在21 d后繼發(fā)側足腫脹明顯降低（P＜0.01）；防風石油醚部位組大鼠在21 d 時繼發(fā)側足腫脹明顯降低（P＜0.05），28 d 時具有顯著差異（P＜0.01）；防風醋酸乙酯部位組及水部位組大鼠繼發(fā)側足腫脹無顯著性差異。結果見表6。

3.7 對關節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和PGE2的含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，防風總提取物、正丁醇部位和羌活顯著降低CIA 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和PGE2的含量（P＜0.05、0.01）；防風石油醚部位可降低CIA 大鼠血清中IL-1β、TNF-α 和PGE2含量（P＜0.05、0.01）；防風醋酸乙酯部位可降低大鼠血清中PGE2含量（P＜0.05）；水部位雖有降低關節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子的趨勢，但無統(tǒng)計學差異。結果見表7。

表5 防風不同部位對關節(jié)炎大鼠原發(fā)側足趾腫脹度的影響 ( ± s , n=10)Table 5 Effect of different extracts parts of S.divaricata on primary side paw swelling in CIA rats (± s , n=10)

表5 防風不同部位對關節(jié)炎大鼠原發(fā)側足趾腫脹度的影響 ( ± s , n=10)Table 5 Effect of different extracts parts of S.divaricata on primary side paw swelling in CIA rats (± s , n=10)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同**P＜ 0.01 vs control group；#P＜ 0.05 ##P＜ 0.01 vs model group, same as below

組別 劑量/(g·kg-1) 7 d 14 d 腫脹度/mL 21 d 28 d 對照 — 0.08±0.06 0.12±0.10 0.17±0.11 0.21±0.10 模型 — 0.68±0.12** 1.25±0.28** 1.21±0.26** 1.22±0.28** 羌活 5.0 0.63±0.13 1.01±0.19# 0.94±0.20## 0.91±0.18## 防風石油醚部位 5.0 0.65±0.14 1.13±0.24 1.09±0.23 1.01±0.20# 防風醋酸乙酯部位 5.0 0.64±0.15 1.21±0.26 1.16±0.27 1.18±0.27 防風正丁醇部位 5.0 0.64±0.11 1.11±0.21 1.01±0.20# 0.97±0.19## 防風水部位 5.0 0.62±0.13 1.19±0.29 1.19±0.26 1.16±0.28 防風總提取物 5.0 0.66±0.14 1.04±0.18# 0.97±0.18# 0.94±0.17##

表6 防風不同部位對關節(jié)炎大鼠繼發(fā)側足趾腫脹度的影響 (± s , n=10)Table 6 Effect of different extracts parts of S.divaricata on secondary side paw swelling in CIA rats (± s , n=10)

表6 防風不同部位對關節(jié)炎大鼠繼發(fā)側足趾腫脹度的影響 (± s , n=10)Table 6 Effect of different extracts parts of S.divaricata on secondary side paw swelling in CIA rats (± s , n=10)

組別 劑量/(g·kg-1) 腫脹度/mL 7 d 14 d 21 d 28 d 對照 — 0.08±0.07 0.11±0.08 0.18±0.11 0.21±0.11 模型 — 0.36±0.14** 0.61±0.18** 0.83±0.22** 0.80±0.21** 羌活 5.0 0.27±0.11 0.43±0.16# 0.58±0.15## 0.52±0.14## 防風石油醚部位 5.0 0.33±0.12 0.53±0.21 0.65±0.18# 0.58±0.18## 防風醋酸乙酯部位 5.0 0.35±0.15 0.60±0.21 0.75±0.24 0.72±0.23 防風正丁醇部位 5.0 0.31±0.09 0.49±0.18 0.61±0.17## 0.55±0.17## 防風水部位 5.0 0.34±0.12 0.63±0.20 0.78±0.24 0.75±0.22 防風總提取物 5.0 0.33±0.11 0.45±0.17# 0.56±0.16## 0.53±0.16##

表7 防風不同部位對關節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子的影響 (± s , n=10)Table 7 Effect of different extracts parts of S.di varicata on serum contents of inflammatory factors in CIA rats (± s , n=10)

表7 防風不同部位對關節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子的影響 (± s , n=10)Table 7 Effect of different extracts parts of S.di varicata on serum contents of inflammatory factors in CIA rats (± s , n=10)

組別 劑量/(g·kg-1) IL-1β/(ng·L-1) IL-6/(ng·L-1) TNF-α/(ng·L-1) PGE2/(ng·L-1) 對照 — 25.68±3.91 32.78±6.56 76.29±12.81 114.26±19.23 模型 — 116.31±28.75** 55.85±11.26** 121.58±23.09** 176.81±28.16**羌活 5.0 61.87±15.61## 41.71±7.63## 87.05±15.36## 127.19±21.34##防風石油醚部位 5.0 96.09±21.31# 49.58±8.73 102.88±19.60# 146.28±24.10##防風醋酸乙酯部位 5.0 104.35±23.86 48.73±9.16 107.25±20.81 154.78±25.16# 防風正丁醇部位 5.0 74.15±19.20## 45.76±8.22# 92.36±17.73## 138.94±23.51##防風水部位 5.0 108.96±26.83 53.69±10.25 114.12±24.67 166.26±29.33 防風總提取物 5.0 68.08±17.29## 39.86±7.98## 85.27±16.28## 133.60±22.86#

3.8 對關節(jié)炎大鼠組織病理學的影響

病理學觀察結果顯示，對照組大鼠關節(jié)滑膜組織完整，可見清晰的關節(jié)腔，無充血水腫，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠滑膜細胞顯著增生，關節(jié)間隙變窄，炎性細胞明顯浸潤；防風正丁醇部位組、總提取物組和羌活組大鼠關節(jié)滑膜細胞增生明顯減少，可見少量炎性細胞浸潤；防風石油醚部位組大鼠滑膜細胞增生、炎性細胞浸潤程度較模型組減輕，但不及防風總提取物組；防風醋酸乙酯部位組和水部位組大鼠滑膜病理情況較模型組未有明顯改善。結果見圖2。

圖2 各組大鼠踝關節(jié)組織病理學形態(tài) (HE，×200)Fig.2 Pathological observation of ankle of CIA rats in each group (HE , × 200)

3.9 對關節(jié)炎大鼠滑膜中AQP-1 表達的影響

與對照組比較，CIA 模型大鼠滑膜組織中AQP-1 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，羌活、防風石油醚部位及總提取物組大鼠滑膜組織中AQP-1 的表達均明顯降低（P＜0.05、0.01）；防風醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位對關節(jié)炎大鼠滑膜中AQP-1 表達無明顯影響。結果見圖3。

圖3 防風不同提取部位對關節(jié)炎大鼠AQP-1 表達的影響Fig.3 Effect of different extracts parts of S.divaricata on protein expression of AQP-1 in CIA rats

4 討論

風藥是中藥傳統(tǒng)分類中的一大類別，風藥之名，源于金代張元素在《醫(yī)學啟源》論述：“羌活，氣微溫，味甘苦，治肢節(jié)疼痛，手足太陽經(jīng)風藥也”，此后，其弟子李東垣師承其說，明確提出“風藥”名稱，并用于內傷脾胃諸病治療。風藥辛燥，故能祛除濕邪、治療濕證，即風能勝濕。燥性是中藥的性能之一，燥能除濕是中藥發(fā)揮治療作用的基礎，燥勝則干是藥物產(chǎn)生副作用的因素[6]。風藥的辛燥之性常產(chǎn)生傷陰耗陽之弊，一定程度限制了風藥的應用。防風為風藥的典型代表，辛甘微溫，可祛風解表、勝濕止痛、升清燥濕，用于外感表證、風濕痹痛及脾虛濕盛等病證，其質松而潤，被譽為“風藥中之潤劑”。因此，對防風既能燥濕又不傷陰的作用及其機制進行研究，有助于拓展風藥的臨床應用，也為詮釋中藥燥性的科學內涵提供參考。

燥勝則干，辛燥中藥易導致一系列干燥失潤的癥狀，表現(xiàn)為口渴多飲、口鼻及皮膚干燥、大便干結等[7]，故本實驗選擇大鼠飲水量、尿量、大便含水量等指標來考察防風不同提取部位的燥性，同時選擇辛香溫燥的風藥羌活為對照。結果顯示羌活總提取物、防風石油醚部位ig 正常大鼠后，飲水量、尿量明顯增加，糞便含水量降低，其他提取部位和防風總提取物對大鼠的上述燥性指標無明顯影響，表明防風石油醚部位具有一定的燥性。過燥傷陰，機體津液損耗，致使陽氣亢盛，表現(xiàn)為陰虛燥熱。血漿cAMP 與cGMP 呈拮抗性共同參與細胞反應的調節(jié)，可以反映機體的陰陽狀態(tài)。而中醫(yī)認為津血同源，津傷則血損，表現(xiàn)最直接的就是血液流變學指標的改變，故可將cAMP、cGMP、血液流變學作為衡量中藥燥性指標[8]。本研究結果顯示，防風石油醚部位、羌活ig 正常大鼠后，血清中cAMP 的含量和cAMP/cGMP 值均顯著升高，中、低切變率下的全血黏度明顯增加，防風其他提取部位和總提取物未見有顯著差異，提示防風石油醚部位可能會影響水液轉運代謝從而造成正常大鼠出現(xiàn)傷陰癥狀，防風其他部位及總提取物則無明顯的燥性效應。

口干咽燥、大便干結等燥性癥狀與機體的津液輸布有關，AQP 作為存在于細胞膜上的選擇性轉運水分子的通道蛋白，介導水液的跨膜運輸，與機體津液的分布密切相關。AQP 有多種亞型，在不同的組織器官中，AQP 表達的亞型不同，即使亞型相同，表達量也不相同，從而導致對水的通透性差異[9]。頜下腺是機體重要的唾液分泌腺，主要表達AQP-5，藥物可通過影響AQP-5 進而抑制腺體的分泌，產(chǎn)生口渴多飲[10]。AQP-4 和AQP-9 均在結腸中表達，但其表達細胞有差異，AQP-4 表達于升結腸的吸收上皮細胞，主要參與腸道的吸收功能，AQP-9 則主要表達在降結腸的杯狀細胞，主要參與腸道的分泌而潤滑糞便[11]。AQP-2 是抗利尿激素敏感性蛋白，主要分布于腎臟集合管主細胞，在機體缺水狀態(tài)下，抗利尿激素在下丘腦視上核和室旁核中分泌并由垂體釋放，進而促進AQP-2 小泡向腔膜嵌入，并使AQP-2 開放，增加腔膜對水的通透性，促進尿液的重吸收，已有研究表明尿量的增加與AQP-2 表達的降低相關[12]。本研究顯示，羌活、防風石油醚部位明顯降低正常大鼠腎組織AQP-2，頜下腺組織中AQP-5 和結腸中AQP-9 的蛋白表達水平。值得注意的是，防風總提取物對正常大鼠的AQP 并無影響，推測可能是其他極性部位拮抗抑制了石油醚部位下調AQP 的效應。

類風濕關節(jié)炎是常見的自身免疫疾病，其病理特征為炎性細胞與滑膜細胞的增殖和浸潤，導致多關節(jié)炎癥、骨與軟骨組織受損、滑膜增厚、關節(jié)破壞畸形甚至多臟器損傷[13]。類風濕性關節(jié)炎屬中醫(yī)學“痹證”范疇，中醫(yī)認為風寒濕邪侵襲肌肉關節(jié)，邪盛正虛，引起痹證。風藥可發(fā)散達表、勝濕止痛、辛散通絡，論治類風濕性關節(jié)炎契合其病因病機。防風辛溫，祛風散寒、勝濕止痛，為常用的祛風濕、止痹痛的藥物，常與羌活、獨活等配伍。CIA 模型大鼠的臨床表現(xiàn)、病理組織學、免疫學與人類的類風濕性關節(jié)炎最為相似，被認為是研究類風濕性關節(jié)炎理想的動物模型[14]。足趾腫脹度是反映關節(jié)病變程度的主要指標，可通過對大鼠關節(jié)腫脹程度的評定來判斷關節(jié)炎的預后狀況，進而進行藥效學評定。在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中，IL-1β、IL-6 和TNF-α 等促炎細胞因子和炎癥介質PGE2發(fā)揮了重要的致病作用[15]。IL-1β 可誘導滑膜細胞異常增殖，刺激滑膜細胞分泌蛋白激酶，放大IL-6 和TNF-α 的促炎效應；IL-6 參與T 淋巴細胞的分化與活化，誘發(fā)T 細胞引起組織損傷；TNF-α 不僅誘導炎癥、促進纖維細胞增生及組織損傷，而且作為破骨細胞的活化因子導致骨和軟骨的破壞；PGE2可使局部毛細血管擴張，血管通透性升高，引起組織充血水腫。本實驗結果顯示，羌活及防風總提取物、正丁醇部位和石油醚部位可降低CIA 大鼠的足跖腫脹度，改善關節(jié)滑膜組織病理，且藥效強度為防風總提取物＞正丁醇部位＞石油醚部位，而醋酸乙酯部位及水部位對大鼠足腫脹、關節(jié)組織病理無明顯影響。同時，防風總提取物、正丁醇部位和羌活顯著降低CIA 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 和PGE2的水平，石油醚部位可降低血清中IL-1β、TNF-α 和PGE2水平，說明正丁醇部位和石油醚部位可能是防風抗類風濕性關節(jié)炎的有效部位，防風總提取物、正丁醇部位和石油醚部位可能通過抑制炎癥因子的分泌，減輕炎癥反應，從而發(fā)揮保護關節(jié)滑膜的效應。

AQP 異常表達可能是形成濕病的基礎之一，調控AQP 的表達可能是風能勝濕的作用基礎[16]。AQP-1 在類風濕性關節(jié)炎患者的軟骨、滑膜細胞中表達升高。炎癥反應發(fā)生時，致炎因子如TNF-α、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等水平升高，進而調控AQP-1 的表達增加，引起細胞膜水通透性升高，引起細胞水腫變性[17-18]。AQP-1 在維持滑液的動態(tài)平衡起著重要作用，是導致滑膜炎癥、關節(jié)腔積液、血管翳形成以及關節(jié)軟骨與滑膜退變的關鍵因素之一。此外，AQP-1 通過調節(jié)細胞膜對水的跨膜轉運，促進血管內皮細胞的遷移，促進血管新生，新生的血管向滑膜組織運輸炎癥細胞并提供充足養(yǎng)分，加重關節(jié)炎病變程度。本實驗顯示，CIA 大鼠滑膜組織中AQP-1 的蛋白表達較正常大鼠明顯增加，羌活、防風石油醚部位及總提取物可降低CIA大鼠滑膜組織中AQP-1 的表達，這可能是防風勝濕的作用機制之一。由于不同組織中分布的AQP 亞型不同，且不同亞型的AQP 調控機制不同，推測防風的其他提取部位可能調控了與燥性相關的AQP 亞型，而對AQP-1 無明顯影響。防風不同極性部位對AQP 不同亞型的差異調控，可能是防風表現(xiàn)“風藥中之潤劑”特性的實質。

綜上所述，防風石油醚部位表現(xiàn)出一定的燥性，且具有抗關節(jié)炎的作用，其機制可能與調節(jié)不同組織中不同亞型的AQP 表達有關；防風總提取物具有較好的抗關節(jié)炎作用，但未見明顯的燥性效應，可能是由于防風不同部位對不同亞型的AQP調控具有差異，這需進一步實驗驗證。本研究通過燥性和藥效研究以揭示防風“風藥中之潤劑”的科學內涵，有助于全面認識風藥理論，也為中藥燥性的運用及燥烈傷陰的減緩提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突