• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    葛根素通過(guò)circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4抑制SK-N-SH細(xì)胞氧糖剝奪損傷

    2021-06-11 08:01:30齊獻(xiàn)忠邢英瀛張小林賈燕燕
    中草藥 2021年11期
    關(guān)鍵詞:葛根素熒光素酶存活率

    齊獻(xiàn)忠,邢英瀛,張小林,賈燕燕

    南陽(yáng)市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,河南 南陽(yáng) 473000

    腦卒中是導(dǎo)致殘疾的主要原因,也是全球第2大常見的死亡原因[1]。約87%腦卒中病例為缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS),IS 的死亡率和致殘率一直處于較高水平[2]。有效保護(hù)神經(jīng)元損傷在IS防治中至關(guān)重要[3]。葛根素是從豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi 的根中提取的異黃酮苷類物質(zhì),具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。葛根素被廣泛用于治療急性缺血性中風(fēng)、心臟病和其他全身性疾病[5-6]。環(huán)狀RNA(circRNA)通過(guò)微小RNA(miRNA)或與RNA 結(jié)合蛋白相互作用形成circRNA-miRNA-mRNA 復(fù)合物,在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[7]。研究發(fā)現(xiàn),circRNA 可能參與了IS 的發(fā)病過(guò)程,具有作為IS的新型診斷生物標(biāo)志物和分子治療靶點(diǎn)的潛力[8-9]。在IS 患者和動(dòng)物模型中,circ-絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動(dòng)樣激酶1(tousled-like kinase1,TLK1)表達(dá)明顯上調(diào),敲除circ-TLK1能夠顯著減少腦梗死體積,減少缺血性神經(jīng)元損害并改善神經(jīng)功能缺損[10]。因此,本研究基于circ-TLK1 探究葛根素對(duì)IS 的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用及機(jī)制。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞

    人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 SK-N-SH 購(gòu)自美國(guó)ATCC。

    1.2 藥品與試劑

    葛根素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號(hào)110752-201912)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;DMEM 高糖培養(yǎng)基(批號(hào)1912)購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;胎牛血清(批號(hào)SN201909)購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(批號(hào)L3000-015)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;MTT(批號(hào)MKBP6775V)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;circ-TLK1過(guò)表達(dá)載體及空載 Vector、circ-TLK1小干擾RNA(si-circ-TLK1)、siRNA 陰性對(duì)照(si-NC)、miR-367-3p模擬物(miR-367-3p mimics)、miR-367-3p抑制劑(miR-367-3p inhibitors)及相應(yīng)對(duì)照、Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒和空載pcDNA 均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20191120)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20190608)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒(批號(hào)MK1020)購(gòu)自日本Takara 公司;雙熒光素酶標(biāo)記試劑盒(批號(hào)E2920)、pmirGLO 載體(批號(hào)E1330)購(gòu)自美國(guó)Promega 公司;RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP,批號(hào)KT102-01)購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司;TLR4 單抗、HRP 標(biāo)記的IgG 二抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司;RIPA 裂解液(批號(hào)P0013)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;BCA 蛋白定量試劑盒(批號(hào)PC0020)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

    1.3 儀器

    CR21GⅡ型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自日本日立公司;T-1186-340-LA 型超低溫冰箱購(gòu)自天地精儀科技;MAXM5 型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美谷分子儀器;YXQ-LS-75G 型高壓滅菌鍋購(gòu)自諾基儀器;流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京儀美信科技。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    SK-N-SH 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基,于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    2.2 氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)對(duì)SK-N-SH 細(xì)胞存活率的影響

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH 細(xì)胞,以2×104/孔接種于6 孔板中,待細(xì)胞貼壁后使用PBS 洗滌3 次,用不含血清、無(wú)糖的DMEM 培養(yǎng)基,于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6、12、24 h;將培養(yǎng)基更換成DMEM 高糖培養(yǎng)基,于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,建立OGD 細(xì)胞模型[11]。加入100 μL MTT 孵育4 h,棄上清,加入二甲基亞砜(DMSO),振蕩至結(jié)晶完全溶解,采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm 處的吸光度(A),計(jì)算細(xì)胞存活率。

    2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH 細(xì)胞,以2×104/孔接種于6 孔板中,培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí),按照試劑盒說(shuō)明書將circ-TLK1過(guò)表達(dá)載體及空載Vector、si-circ-TLK1(5’-GGACATCTCAAA- AAGGCAACA-3’)及si-NC、miR-367-3pmimics、miR-367-3pinhibitors 及相應(yīng)對(duì)照、TLR4過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒及空載pcDNA 轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細(xì)胞。

    2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SK-N-SH 細(xì)胞,以2×104/孔接種于6 孔板中,培養(yǎng)12 h,加入不同質(zhì)量濃度(20、40、80 μg/mL)的葛根素或用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,對(duì)照組加入不含藥物的無(wú)糖DMEM 培養(yǎng)基,于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;將培養(yǎng)基更換成DMEM 高糖培養(yǎng)基,于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按“2.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

    2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

    按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞,收集細(xì)胞,分別加入Annexin V-FITC 和PI 染液,孵育15 min,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

    2.6 ELISA 法檢測(cè)上清液中IL-6 和TNF-α 水平

    按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞,收集上清液,按ELISA 試劑盒說(shuō)明書測(cè)定IL-6 和TNF-α 水平。

    2.7 qRT-PCR 檢測(cè) circ-TLK1 和 miR-367-3p mRNA 表達(dá)情況

    按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞,收集細(xì)胞,按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA 并合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR 分析。引物序列見表1,將U6作為miR-367-3p內(nèi)參,將GAPDH作為circ-TLK1內(nèi)參。

    2.8 雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)熒光素酶活性

    將包含miR-367-3p結(jié)合位點(diǎn)的circ-TLK1的野生型序列(WT-circ-TLK1)或不具有miR-367-3p 結(jié)合位點(diǎn)的突變體(MUT-circ-TLK1)插入pmirGLO載體,將質(zhì)粒與miR-367-3p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細(xì)胞,采用雙熒光素酶標(biāo)記試劑盒考察熒光素酶活性。

    表1 引物信息Table 1 Primer information

    2.9 RIP 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-367-3p 與circ-TLK1 和TLR4 結(jié)合關(guān)系

    以預(yù)冷的PBS 洗滌SK-N-SH 細(xì)胞2 次,加入裂解液于冰上裂解,收集上清液,于 -80 ℃保存。制備重懸磁珠,加入IgG 或Ago2 抗體孵育,棄上清,以洗滌液洗滌3 次,加入免疫沉淀緩沖液,離心取上清,提取免疫沉淀的RNA,并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè),以確認(rèn)結(jié)合靶點(diǎn)的富集水平。

    2.10 Western blotting 法檢測(cè)TLR4 蛋白表達(dá)情況

    按“2.4”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞,收集細(xì)胞,加入RIPA 裂解液,提取蛋白,蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF 膜,于5%脫脂牛奶封閉2 h,加入TLR4 抗體(1∶1000),4 ℃孵育過(guò)夜;洗滌3 次后,加入HRP 標(biāo)記的IgG 二抗,孵育2 h,使用ECL 試劑盒顯色,采用Image J軟件分析。

    2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)以±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

    3 結(jié)果

    3.1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷

    如圖1-A 所示,隨著OGD 作用時(shí)間的延長(zhǎng),SK-N-SH 細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05、0.01、0.001),后續(xù)選擇12 h 作為OGD 的處理時(shí)間。如圖1-B~D 所示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.001),凋亡率顯著升高(P<0.001),IL-6 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.001);與模型組比較,葛根素組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05、0.01、0.001),細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01、0.001),IL-6 和TNF-α 水平顯著降低(P<0.01、0.001),表明葛根素對(duì)OGD 致細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,選擇40 μg/mL 葛根素進(jìn)行后續(xù)研究。

    圖1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷Fig.1 Puerarin inhibited SK-N-SH cells damage induced by OGD

    3.2 過(guò)表達(dá)circ-TLK1 逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

    如圖2 所示,與對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);與模型組比較,葛根素組細(xì)胞circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.001),表明葛根素對(duì)OGD致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與circ-TLK1的表達(dá)有關(guān)。轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)circ-TLK1后,細(xì)胞circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平表達(dá)顯著升高(P<0.001),細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01),IL-6 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.01、0.001),表明過(guò)表達(dá)circ-TLK1能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

    圖2 過(guò)表達(dá)circ-TLK1 逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.2 Overexpression of circ-TLK1 reversed protective effect of puerarin on SK-N-SH cells injury induced by OGD

    3.3 葛根素通過(guò)circ-TLK1 靶向調(diào)控miR-367-3p對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

    如圖3 所示,采用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)circ-TLK1的下游靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)miR-367-3p和circ-TLK1間存在特異性靶向結(jié)合位點(diǎn),提示miR-367-3p可能是circ-TLK1的直接靶點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-367-3p和circ-TLK1的靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-367-3p 組WT-circ-TLK1 熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.001),MUT-circ-TLK1 熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯改變;與IgG 組相比,Ago2組miR-367-3p和circ-TLK1的富集水平均顯著升高(P<0.001),表明miR-367-3p可通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)與circ-TLK1特異性結(jié)合。

    圖3 circ-TLK1 與miR-367-3p 靶向調(diào)控作用Fig.3 Targeted regulation of circ-TLK1 and miR-367-3p

    與對(duì)照組相比,模型組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.001);與si-NC 組相比,si-circ-TLK1組circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.001),miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與Vector組相比,circ-TLK1 組circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高(P<0.001),miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),表明circ-TLK1能夠靶向負(fù)調(diào)控miR-367-3p的表達(dá)。

    如圖4 所示,與對(duì)照組相比,模型組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.001);與模型組相比,葛根素組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高(P<0.001),表明葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與miR-367-3p的表達(dá)有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染抑制miR-367-3p表達(dá),結(jié)果顯示,與葛根素+anti-miR-NC 組相比,葛根素+anti-miR-367-3p 組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.001),細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.001),IL-6 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.001),表明抑制miR-367-3p能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

    圖4 葛根素通過(guò)促進(jìn)miR-367-3p 表達(dá)對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用Fig.4 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by promoting miR-367-3p expression

    3.4 葛根素通過(guò)miR-367-3p 靶向調(diào)控TLR4 對(duì)OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

    如圖5 所示,采用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)miR-367-3p的下游靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-367-3p和TLR4間存在特異性靶向結(jié)合位點(diǎn),提示TLR4可能是miR-367-3p的直接靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和RIP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-367-3p和TLR4的靶向關(guān)系,結(jié)果顯示,與miR-NC 組相比,miR-367-3p組WT-TLR4 熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.001),MUT-TLR4 熒光素酶相對(duì)活性無(wú)明顯改變;與IgG 組相比,Ago2 組TLR4和circ-TLK1的富集水平顯著升高(P<0.001),表明miR-367-3p可通過(guò)結(jié)合位點(diǎn)與TLR4特異性結(jié)合。

    圖5 TLR4 和miR-367-3p 靶向調(diào)控作用Fig.5 Targeted regulation of TLR4 and miR-367-3p

    與對(duì)照組相比,模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);與miR-NC 組相比,miR-367-3p組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著升高(P<0.001),TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001);與 anti-miR-NC組相比, anti-miR-367-3p 組miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001),表明miR-367-3p能夠靶向負(fù)調(diào)控TLR4表達(dá)。

    如圖6 所示,與對(duì)照組相比,模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);與模型組相比,葛根素組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001),表明葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與TLR4 表達(dá)有關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)TLR4,結(jié)果顯示,與葛根素+pcDNA 組相比,葛根素+TLR4 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001),細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.001),IL-6 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.001),表明過(guò)表達(dá)TLR4能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

    圖6 葛根素通過(guò)抑制TLR4 表達(dá)對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用Fig.6 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by inhibiting TLR4 expression

    3.5 葛根素通過(guò)調(diào)控 circ-TLK1/miR-367-3p/ TLR4 抑制OGD 所致的SK-N-SH 細(xì)胞損傷

    如圖7 所示,與對(duì)照組相比,模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);與si-NC 組相比,si-circ-TLK1 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001);與si-circ-TLK1+anti-miR-NC 組相比,si-circ-TLK1+anti-miR-367-3p 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,葛根素組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001);與葛根素+Vector 組相比,葛根素+circ-TLK1 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.001);與葛根素+anti-miR-NC 組相比,葛根素+anti-miR-367-3p 組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。

    圖7 葛根素對(duì)circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 的調(diào)控作用Fig.7 Regulatory effect of puerarin on circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4

    4 討論

    IS 為危害我國(guó)中老年人健康及生活質(zhì)量的主要疾病,具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn),葛根中的葛根素可以改善血液循環(huán)并減少心血管和腦血管疾?。桓鸶啬軌驕p少腦缺血再灌注引起的神經(jīng)元損傷,并降低腦卒中神經(jīng)細(xì)胞損傷過(guò)程[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)葛根素可以有效提高OGD 誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞存活率,降低細(xì)胞凋亡率,降低IL-6 和TNF-α 水平,表明葛根素對(duì)IS 神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

    CircRNA 在組織中特異性表達(dá),具有高度同源性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等特點(diǎn)[18-19]。本研究結(jié)果顯示,OGD誘導(dǎo)的SK-N-SH 細(xì)胞中circ-TLK1mRNA 表達(dá)水平顯著升高,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10];葛根素顯著下調(diào)circ-TLK1mRNA 表達(dá),過(guò)表達(dá)circ-TLK1能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,表明葛根素通過(guò)降低SK-N-SH 細(xì)胞中circ-TLK1表達(dá),從而發(fā)揮抗腦卒中的作用。circRNA 通常被用作miRNA 的分子海綿來(lái)調(diào)節(jié)mRNA 表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),miR-367-3p具有明顯的抗IS 的作用[20]。本研究結(jié)果顯示,miR-367-3p為circ-TLK1的靶miRNA,circ-TLK1可以負(fù)向調(diào)節(jié)miR-367-3p表達(dá);模型組SK-N-SH 細(xì)胞miR-367-3pmRNA 表達(dá)水平明顯降低,葛根素顯著上調(diào)miR-367-3pmRNA 表達(dá),抑制miR-367-3p能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,表明葛根素可能通過(guò)下調(diào)circ-TLK1表達(dá)并上調(diào)miR-367-3p表達(dá),從而發(fā)揮抗腦卒中的作用。

    本研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件搜索miR-367-3p的靶基因,并將TLR4 確認(rèn)為miR-367-3p的直接靶點(diǎn)。miR-497能夠通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4 和環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein,CREB)信號(hào)傳導(dǎo)途徑減輕患者腦梗死[21]。miR-182-5p通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4 介導(dǎo)的炎性反應(yīng),在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[22]。本研究結(jié)果顯示,模型組TLR4 蛋白表達(dá)水平顯著降低,葛根素上調(diào)TLR4 蛋白表達(dá),過(guò)表達(dá)TLR4能夠逆轉(zhuǎn)葛根素對(duì)OGD 致SK-N-SH 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用;此外,circ-TLK1能夠通過(guò)結(jié)合miR-367-3p來(lái)調(diào)節(jié)TLR4 蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明,葛根素通過(guò)circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 軸抑制IS 中的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

    綜上,葛根素能夠有效提高IS 體外模型中SK-N-SH 細(xì)胞存活率,抑制細(xì)胞凋亡,減少炎性因子的分泌,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制與調(diào)控circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 有關(guān)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    葛根素熒光素酶存活率
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    葛根素抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的作用
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬(wàn)噸的魚要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬(wàn)斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    葛根素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVEC-12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:04
    葛根素生物黏附微球的制備及評(píng)價(jià)
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    人多巴胺D2基因啟動(dòng)子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測(cè)
    videossex国产| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久 成人 亚洲| 午夜激情久久久久久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 黄色一级大片看看| 国产精品不卡视频一区二区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成人精品一,二区| 免费黄频网站在线观看国产| 91精品国产九色| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美另类一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 色94色欧美一区二区| 色5月婷婷丁香| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲,欧美,日韩| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品国产av在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久久久久久久丰满| 国产精品蜜桃在线观看| 丝袜脚勾引网站| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 99久久综合免费| 色哟哟·www| 久久精品国产自在天天线| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 最新的欧美精品一区二区| 久久久国产精品麻豆| av有码第一页| 久久久国产精品麻豆| 久久久欧美国产精品| 亚洲av综合色区一区| 午夜老司机福利剧场| 一级a做视频免费观看| 久久国内精品自在自线图片| 26uuu在线亚洲综合色| 男女边摸边吃奶| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜激情av网站| 中文字幕亚洲精品专区| 日韩视频在线欧美| 欧美激情 高清一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 色94色欧美一区二区| 九九在线视频观看精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产成人免费观看mmmm| 国产成人免费无遮挡视频| a级毛片黄视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人漫画全彩无遮挡| 日韩 亚洲 欧美在线| videos熟女内射| 成年人免费黄色播放视频| 国产成人免费观看mmmm| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产精品久久久久久久电影| 黄色视频在线播放观看不卡| 欧美日韩在线观看h| 中文字幕久久专区| 国产黄片视频在线免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产亚洲精品久久久com| 中文字幕人妻丝袜制服| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 97超碰精品成人国产| 国产一级毛片在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 成人国产麻豆网| 搡老乐熟女国产| 在线 av 中文字幕| 黄色欧美视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 99九九在线精品视频| 少妇 在线观看| av黄色大香蕉| 最近中文字幕2019免费版| 最黄视频免费看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 看十八女毛片水多多多| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 狂野欧美激情性bbbbbb| 日日撸夜夜添| 精品一区二区免费观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩视频在线欧美| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲成人手机| 观看美女的网站| 中国国产av一级| 中国三级夫妇交换| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 九九爱精品视频在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩欧美精品免费久久| 91久久精品电影网| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产成人av激情在线播放 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 久久97久久精品| 精品久久久久久久久av| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品自拍成人| 国产欧美亚洲国产| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久综合国产亚洲精品| 嘟嘟电影网在线观看| 国产av一区二区精品久久| 九九在线视频观看精品| 亚洲综合色网址| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲av在线观看美女高潮| 在线观看免费视频网站a站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 草草在线视频免费看| 黄色毛片三级朝国网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久久a久久爽久久v久久| 国产熟女欧美一区二区| 777米奇影视久久| 99久久精品国产国产毛片| 涩涩av久久男人的天堂| 寂寞人妻少妇视频99o| 桃花免费在线播放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 精品人妻在线不人妻| 久久99热6这里只有精品| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 日日撸夜夜添| 国产精品久久久久久精品古装| av又黄又爽大尺度在线免费看| av黄色大香蕉| 欧美丝袜亚洲另类| 精品一区二区三区视频在线| 国产高清有码在线观看视频| 男女边吃奶边做爰视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国内精品宾馆在线| 婷婷色av中文字幕| 免费大片黄手机在线观看| 只有这里有精品99| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 午夜精品国产一区二区电影| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲av.av天堂| 91精品伊人久久大香线蕉| 高清毛片免费看| 在线天堂最新版资源| 在线观看三级黄色| 啦啦啦啦在线视频资源| av有码第一页| 一级片'在线观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡 | 少妇的逼好多水| 午夜激情av网站| 国产毛片在线视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 最后的刺客免费高清国语| 国产成人精品一,二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产片内射在线| 日韩一区二区三区影片| 欧美最新免费一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 婷婷色av中文字幕| 精品熟女少妇av免费看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 超碰97精品在线观看| av有码第一页| 免费av中文字幕在线| 丝袜在线中文字幕| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 色哟哟·www| 妹子高潮喷水视频| 制服丝袜香蕉在线| 激情五月婷婷亚洲| 老熟女久久久| 亚洲精品自拍成人| 日日摸夜夜添夜夜爱| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产黄色免费在线视频| 免费观看无遮挡的男女| 国产淫语在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久韩国三级中文字幕| 日韩电影二区| av福利片在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲性久久影院| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人aa在线观看| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲av男天堂| 青春草国产在线视频| 黄色一级大片看看| 成人国产av品久久久| 成人国产av品久久久| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 18禁在线播放成人免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品国产亚洲av天美| 在线播放无遮挡| av网站免费在线观看视频| 制服诱惑二区| 日本vs欧美在线观看视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 另类亚洲欧美激情| av免费观看日本| 2021少妇久久久久久久久久久| 熟女av电影| 少妇被粗大猛烈的视频| 一区二区三区乱码不卡18| 午夜精品国产一区二区电影| 精品酒店卫生间| 两个人的视频大全免费| 亚洲av.av天堂| 精品少妇内射三级| 欧美 日韩 精品 国产| 国产探花极品一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 91国产中文字幕| 午夜久久久在线观看| av电影中文网址| 婷婷成人精品国产| 久久这里有精品视频免费| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲av不卡在线观看| 午夜视频国产福利| 天堂中文最新版在线下载| 最近最新中文字幕免费大全7| 99久久综合免费| 妹子高潮喷水视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 18禁在线播放成人免费| 国产高清三级在线| av福利片在线| 久久99热6这里只有精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产黄频视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品三级大全| 亚洲图色成人| 91aial.com中文字幕在线观看| 国内精品宾馆在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费观看性生交大片5| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成人黄色视频免费在线看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 99国产精品免费福利视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久人人爽人人片av| 赤兔流量卡办理| 色94色欧美一区二区| 热99久久久久精品小说推荐| 免费观看av网站的网址| 十分钟在线观看高清视频www| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精品456在线播放app| 大香蕉久久网| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日韩亚洲欧美综合| av视频免费观看在线观看| 国产极品天堂在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 自线自在国产av| 九九在线视频观看精品| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩欧美精品免费久久| 特大巨黑吊av在线直播| 久热这里只有精品99| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 国产 精品1| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日本欧美视频一区| 欧美日韩在线观看h| av电影中文网址| 成人午夜精彩视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产极品天堂在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本91视频免费播放| 欧美精品一区二区大全| 99久久中文字幕三级久久日本| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲第一av免费看| 国产永久视频网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 晚上一个人看的免费电影| videosex国产| 日韩大片免费观看网站| 国产精品一区www在线观看| 日韩成人伦理影院| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 综合色丁香网| 国产视频内射| 午夜视频国产福利| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 有码 亚洲区| 曰老女人黄片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩强制内射视频| 另类精品久久| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久久精品久久久久真实原创| 热re99久久国产66热| 久久久国产欧美日韩av| 高清午夜精品一区二区三区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 日韩制服骚丝袜av| 午夜福利影视在线免费观看| 免费黄频网站在线观看国产| 看免费成人av毛片| 精品国产一区二区久久| 国产精品久久久久久av不卡| 亚洲精品一区蜜桃| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 少妇的逼好多水| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美最新免费一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 三级国产精品片| 国产精品一区二区在线观看99| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 亚洲五月色婷婷综合| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品少妇黑人巨大在线播放| 桃花免费在线播放| 99热6这里只有精品| 99国产精品免费福利视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 中文欧美无线码| 热re99久久国产66热| 精品一品国产午夜福利视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 热re99久久国产66热| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产精品国产三级专区第一集| 日日爽夜夜爽网站| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 中文天堂在线官网| 色视频在线一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲精品色激情综合| 99国产综合亚洲精品| 七月丁香在线播放| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 美女主播在线视频| 亚洲av免费高清在线观看| 秋霞伦理黄片| 成人黄色视频免费在线看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 丝袜喷水一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 天美传媒精品一区二区| 国产成人精品一,二区| 欧美日韩视频精品一区| 大香蕉97超碰在线| 国产成人freesex在线| 日韩三级伦理在线观看| 久久久精品区二区三区| 久久人妻熟女aⅴ| 黄片播放在线免费| 黄色欧美视频在线观看| 日本午夜av视频| 能在线免费看毛片的网站| 午夜免费男女啪啪视频观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产av一区二区精品久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩电影二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲欧美清纯卡通| 97超碰精品成人国产| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美3d第一页| 男女免费视频国产| 搡老乐熟女国产| av黄色大香蕉| 国产极品天堂在线| 婷婷色综合www| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 九色成人免费人妻av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美另类一区| 久久久久久人妻| 18在线观看网站| 成人无遮挡网站| 蜜桃在线观看..| 精品久久蜜臀av无| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美在线一区亚洲| 国产av国产精品国产| 国产高清激情床上av| 美女主播在线视频| 午夜激情av网站| 女性生殖器流出的白浆| 男女高潮啪啪啪动态图| 韩国精品一区二区三区| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲综合色网址| av线在线观看网站| 91国产中文字幕| 岛国在线观看网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久99热这里只频精品6学生| 精品福利永久在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 一个人免费看片子| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 亚洲精品美女久久av网站| 国产成人欧美在线观看 | 麻豆乱淫一区二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久99热这里只频精品6学生| 国产真人三级小视频在线观看| 制服诱惑二区| 欧美成人午夜精品| 满18在线观看网站| 9191精品国产免费久久| 国产在线视频一区二区| 多毛熟女@视频| videos熟女内射| 免费在线观看黄色视频的| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美日本中文国产一区发布| av天堂久久9| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99久久精品国产亚洲精品| 好男人电影高清在线观看| 欧美乱妇无乱码| 黄色视频在线播放观看不卡| 大陆偷拍与自拍| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品二区激情视频| 国产精品一区二区在线不卡| 丁香六月天网| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 成人特级黄色片久久久久久久 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产一区二区三区视频了| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人精品无人区| 香蕉久久夜色| 国产免费现黄频在线看| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲国产看品久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久婷婷成人综合色麻豆| 色精品久久人妻99蜜桃| 99九九在线精品视频| 天堂动漫精品| 精品欧美一区二区三区在线| 18禁观看日本| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 满18在线观看网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 91成人精品电影| 午夜精品久久久久久毛片777| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 极品教师在线免费播放| 成人影院久久| 搡老岳熟女国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品福利观看| 极品教师在线免费播放| 91精品国产国语对白视频| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲精品国产区一区二| 电影成人av| 五月天丁香电影| 亚洲av第一区精品v没综合| 91精品国产国语对白视频| 精品乱码久久久久久99久播| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美 日韩 精品 国产| 一级,二级,三级黄色视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 99国产精品免费福利视频| 欧美大码av| 国产91精品成人一区二区三区 | 一区福利在线观看| 极品人妻少妇av视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| cao死你这个sao货| 国产成+人综合+亚洲专区| 视频区欧美日本亚洲| 啦啦啦在线免费观看视频4| 黄片小视频在线播放| av天堂在线播放| 欧美精品一区二区大全| 老司机亚洲免费影院| 久久中文字幕人妻熟女| 9色porny在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 夫妻午夜视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | 国产欧美日韩一区二区三| 成人18禁在线播放| 精品人妻在线不人妻| 色尼玛亚洲综合影院| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 精品一区二区三卡| 亚洲综合色网址| 日韩视频在线欧美| 91麻豆av在线| 久久亚洲精品不卡| av又黄又爽大尺度在线免费看| 新久久久久国产一级毛片| bbb黄色大片| 三上悠亚av全集在线观看| tocl精华| 激情视频va一区二区三区| 久久精品成人免费网站| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久久久久久精品吃奶| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 男女下面插进去视频免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品国产高清国产av | 最新的欧美精品一区二区| 手机成人av网站| 在线看a的网站| 精品久久久精品久久久| 黄色视频,在线免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品av久久久久免费| 色婷婷久久久亚洲欧美| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品98久久久久久宅男小说| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产欧美日韩一区二区三| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产免费av片在线观看野外av| 高清av免费在线| 精品亚洲成国产av| 性少妇av在线| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品久久久av美女十八| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男女无遮挡免费网站观看| 成人三级做爰电影| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 欧美日韩精品网址| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 不卡av一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 午夜福利影视在线免费观看| 在线看a的网站| 九色亚洲精品在线播放| 久久性视频一级片|